良好的单细胞转录组样本质量是实验成功的基石。凌恩生物拥有10x和C4两个单细胞测序平台，项目经验丰富，除了常规的小鼠、人类，还处理过感染寄生虫的鱼类组织、海带、海参等样本。这些项目的成功离不开合适的样本质控和数据质控，今天就来和大家分享凌恩生物的单细胞转录组送样秘籍！
一
单细胞转录组送样要求
单细胞转录组测序对样本质量要求较高，核心在于保证细胞的活性和完整性。新鲜组织样本需在离体后30分钟内完成处理并转入专用保存液，全程低温运输，确保细胞活性达到85%以上；样本需经PBS清洗去除血污和坏死组织，细胞数量不少于1×10⁶。对于脂肪、纤维或骨组织等难解离样本，建议提前沟通以优化方案；
若为石蜡包埋样本，则只能选择单细胞核测序方案。建议送样前先取少量样本进行活性质检，确认达标后再正式送样，以避免样本浪费。
二
单细胞转录组质检要求：
样本预处理结束后，进入单细胞制备阶段，开展组织解离、单细胞悬液制备，或者细胞核抽提。如何判断样本质检合格呢？
单细胞核转录组（snRNA-seq）质检主要有以下指标：
1
核膜完整性
● 判定方法：光学显微镜（明场/相差）、荧光染色（DAPI/Hoechst）镜检观察；也可结合流式细胞仪成像。
● 合格标准：细胞核形态呈规则圆形/椭圆形，轮廓清晰、边缘光滑，核膜无破损、无凹陷、无碎片、无渗漏；未见裸露染色质、碎裂核及核内容物外泄。
● 不合格表现：核膜破裂、形态畸形、大量核碎片、染色质弥散。
2
有核率（目标核占比）
● 定义：有效细胞核数量 ÷ 总颗粒数（细胞碎片、杂质、空泡不计入）。
● 合格标准：常规样本有核率 ≥90%；难解离组织最低要求 **≥85%**。
● 意义：避免大量空泡、组织杂质干扰后续测序捕获。
3
结团率（聚团率）
● 定义：两个及以上细胞核粘连形成的团块数量 ÷ 总细胞核数量。
● 合格标准：结团率 ≤20%，无大面积多核聚集体。
● 补充：轻微两两粘连可通过轻柔重悬优化，严重结团会导致测序文库无效、数据污染。
4
细胞核活率
● 单细胞核无 “细胞活率” 概念，一般用核完整性、膜通透性染色替代评估：
● 染色方案：DAPI（全核染色）+ 台盼蓝 / PI（破损核染色）。
● 判定逻辑：完整核膜可排斥染料，仅破损核着色。
● 合格标准：完整细胞核占比 ≥90%；PI /台盼蓝阳性（破损核）占比＜10%。
5
浓度
● 计数仪/显微镜定量，浓度需匹配上机要求（常规上机浓度：700 cell /μL），浓度偏差过大需重悬、浓缩或者稀释，细胞总量＞7w。
● 无过组织碎片、胞质残渣、色素颗粒等杂质，同一样本细胞核粒径差异小，无超大核、微型碎片核混杂。
图1 抽核样本质控图
对于解离单细胞的样本质检为两个标准：
A:细胞完整、结团率<20%、活率>90%、 浓度为≥700 cells/μL、无过多细胞碎片、杂质；细胞总量>7万满足所有条件可进行后续实验。
C:细胞不完整、结团率>20%、活率<90%、浓度为<700 cells/μL、过多细胞碎片、杂质;细胞总量<7万。符合其中任何一个条件都不进行后续实验。
图2 解离单细胞转录组样本质控示意图
样本质检完成后，我们根据质检报告，来筛选合格样本进行建库测序。
三
单细胞转录组送样注意事项
为了保证样本的质量，以下的事项务必留意：
1. 样本应尽可能新鲜：如果是组织样本，离体后最好在半小时内浸入保存液中；细胞样本应尽快送样进行实验。
2. 冷藏运输：送样全程应保持4℃左右的低温条件，严禁常温或冷冻运输，避免损伤细胞。
3. 避免反复冻融和剧烈震荡，操作时需小心谨慎。
四
数据质控
把好了样本质量关，就为后续的数据质量上了一层保险。数据质控的目的是区分哪些是值得信任的真实细胞的信号，哪些更可能是低质量细胞、死亡细胞、破裂细胞、双细胞、空液滴或受到明显污染的信号，去除背景噪音污染。
单细胞数据质控的核心指标主要包括以下几种：
1. nCount RNA：表示每个细胞的总计数，反映一个细胞在测序后“总共捕获到的RNA信号”。数值太低提示捕获不足或细胞质量差；太高则提示双细胞或多细胞。
2. nFeature RNA：每个细胞检测到的基因数，能够反映细胞表达谱的复杂度。一般与nCount RNA进行联合判断，数值太高提示双细胞或多细胞，太低则提示捕获不足。
3. Percent.mt：线粒体基因计数占总数的比例，该指标偏高提示细胞受损、应激或死亡。
4. 核糖体RNA比例（riboRatio）：该指标辅助判断某些细胞是否存在明显的核糖体比例偏高现象，但不是首选质控指标。
5. 血红蛋白基因比例（HbRatio）：如果是来自血液、骨髓或存在红细胞污染风险的样本，该指标可辅助识别是否存在红细胞污染。
图3 双细胞过滤示意图
图4 细胞质量评估示意图
图5 单细胞转录组样本整合后的UMAP三维图
俗话说：好的开始是成功的一半。单细胞转录组样本+数据的双重质控，从源头把好样本质量关，到精准把控数据质控，我们全程的严格质控，将为您的单细胞测序打下夯实的地基，为您的实验数据保驾护航，助力您的文章分数“扶摇直上九万里”。
