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我们经常在一些顶刊文章中看到下图这样的荧光共定位分析结果图，如下，图中不仅有荧光显微照片，还有不同颜色通道的信号密度折线图，定性分析+定量分析，双管齐下！
那么，如何对荧光照片进行定量分析？这里用到 ImageJ 软件，一个开源免费的科研图像处理分析工具。下面就以第1个案例中的图片为例，看下如何进行荧光密度定量分析吧！
首先，通过 ImageJ 的 File 菜单下的 Open 命令打开需要分析的单通道或融合通道荧光图片，如下图。如果是Merge后的RGB图片，可通过 Image/Color/Split channels 将其拆分成红绿蓝（RGB）单通道灰度图片。注意，即使是含洋红、青色荧光的融合照片，ImageJ也只能拆分出红绿蓝三通道。
为了对多张照片的同一位置进行灰度分析，通过Image/ Stacks /Images to stack，将需要分析的照片进行堆栈（Stack）。
然后选择工具栏中的直线工具，在选定堆栈图像上感兴趣的区域划线，为了方便观察，我这里在堆栈中的第3张融合图像上划线。
接着，拖动堆栈窗口下方的滑块切换到Red通道图像，通过 Analyze/Plot profile 进行灰度分析。
在弹出的灰度变化折线图中，横轴代表线上各像素点，纵轴为各点对应的灰度值。点击List按钮可查看作图数据，然后保存为CSV格式的表格便于重新绘图。
同样的方法，拖动堆栈窗口下方的滑块切换到Green通道图像，继续通过 Analyze/Plot profile 进行灰度分析，并保存作图数据。
通过 Excel 打开上文保存的灰度数据，合并数据，然后复制到 Prism 中进行图表重绘，数据类型选择XY，如下图。
点击左侧导航栏中 Graphs 菜单下的 Data1，然后选择图表类型为折线图即可看到绘制结果。
将图例拖动到图表上方，双击绘图区的折线，在弹出的 Format Graph 窗口中可调整折线的粗细和颜色，这里的颜色选择与荧光信号颜色一致。
双击坐标轴标题可修改标题的文本内容，最终的绘制效果如下，之后导出图片后与原始荧光照片进行组合即可用于文章发表！
ImageJ不需要安装，下载后直接解压即可使用，软件甚至在U盘中都能打开使用。
官方链接：https://imagej.net/ij/index.html
当然，你也可以选择功能更强大而且已经预装很多插件的 Fiji ，下载地址：
https://imagej.net/software/fiji/downloads
同样，Fiji 软件无需安装，直接打开使用即可！注意：不要将 Fiji 放在含有中文的路径下，否则软件会闪退。
https://doi.org/10.1038/s41586-026-10566-9
https://doi.org/10.1038/s41586-024-07835-w
https://doi.org/10.1038/s41586-026-10610-8
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