细胞划痕实验与图像定量操作指南
细胞迁移参与上皮修复、组织形成等过程。
将连续细胞单层中的一部分细胞移除后，缺口两侧的细胞可以向空白区域移动，使缺口逐渐缩小。
经典划痕实验方法采用人工制作缺口、定时成像和图像比较，具有操作直观、设备要求相对基础的特点。
这个实验的难点集中在几个细节：细胞铺得是否均匀、划痕是否一致、后续是否拍到同一位置，以及闭合变化是否伴随增殖或细胞损伤。
把这些环节控制好，图像才适合定量比较。
建立宽度相近、边缘清楚的细胞划痕。
连续记录同一视野内的缺口变化。
使用图像分析软件测量未闭合区域面积，计算各时间点的划痕闭合率。
识别增殖、细胞死亡、初始缺口差异和拍摄位置变化造成的混杂影响。
预期获得每个培养孔的闭合曲线，以及包含原始图像、区域标注和面积数据的完整记录。
设某个固定视野在初始时刻的划痕面积为 A₀，时间 t 的未闭合面积为 Aₜ。
划痕闭合率为：
剩余缺口比例为：
两者之和为100%。
这里测量的是缺口面积变化。
细胞向缺口移动、细胞分裂以及细胞铺展，都可能使面积减小；死亡或脱落则可能使面积增大。
低血清培养和增殖抑制处理各自会影响细胞状态，需要事先验证。仪器厂商的方法说明也强调，使用增殖抑制剂前应确认其对存活和迁移能力的影响。
以实验室已建立稳定培养条件的 HaCaT 细胞为例。
该细胞有采用高糖培养基并补充10%胎牛血清的培养记录；实际基础培养条件应与所购细胞的说明及实验室验证结果一致。
试剂：基础培养基
规格或用途：适合所用HaCaT细胞的高糖培养基
配制与管理：核对葡萄糖、谷氨酰胺及 丙酮酸钠组成，记录实际货号
试剂：胎牛血清
规格或用途：细胞培养级，同一批次
配制与管理：按厂家要求储存； 分装后减少反复冻融
试剂：完全培养基
规格或用途：基础培养基＋10%胎牛血清
配制与管理：45 mL基础培养基 ＋5 mL胎牛血清
试剂：实验培养基
规格或用途：基础培养基＋1%胎牛血清
配制与管理：49.5 mL基础培养基 ＋0.5 mL胎牛血清； 作为预实验起始条件
试剂：缓冲盐溶液
规格或用途：无钙、无镁，细胞培养级
配制与管理：用于轻柔清洗； 使用前适当预温
试剂：细胞解离试剂
规格或用途：按细胞供应商及既定传代规程选择
配制与管理：用于实验前常规传代
试剂：待测处理液
规格或用途：根据研究目的设置
配制与管理：预先确定工作浓度、溶剂 终浓度及细胞耐受性
试剂：细胞状态检测试剂
规格或用途：适合细胞计数、存活或增殖评价
配制与管理：在平行样品中使用
记录试剂生产商、目录号、批号、开封日期和有效期。
实验培养基中的1%血清需要先确认能够维持观察期内的细胞贴壁和基本健康状态。
减少血清可以降低部分增殖刺激，同时也可能改变迁移和存活。
本基础流程采用划痕后统一换入实验培养基的方式。额外的血清饥饿或增殖抑制处理，应作为独立变量验证后再加入。
耗材：细胞培养板
建议规格：24孔，组织培养处理表面
用途：铺板及划痕观察
耗材：无菌吸头
建议规格：200 μL，同品牌、同型号
用途：制作划痕
耗材：移液器及吸头
建议规格：覆盖200～1000 μL
用途：加液、洗涤和换液
耗材：计数耗材
建议规格：血球计数板或自动计数配套耗材
用途：确定活细胞接种量
耗材：定位用品
建议规格：细头耐水记号笔
用途：在培养板底部外侧标记
耗材：细胞培养耗材
建议规格：无菌离心管、培养瓶等
用途：常规细胞准备
耗材：图像标定工具
建议规格：载物台测微尺或可靠的像素标定
用途：建立长度与面积单位
使用同一型号吸头制作整轮实验的划痕。
吸头外形、倾斜角度和施力方式都会影响缺口宽度，因此正式实验前先练习几孔。
仪器：生物安全柜
建议设置：按实验室细胞操作规程使用
核查内容：清洁、运行及维护状态
仪器：二氧化碳培养箱
建议设置：37 ℃、5%二氧化碳
核查内容：温度、气体浓度与湿度
仪器：倒置相差显微镜
建议设置：4倍或10倍物镜
核查内容：能完整看到缺口两侧边缘
仪器：相机及采集软件
建议设置：固定分辨率、曝光与拍摄模式
核查内容：保存原始图像和采集参数
仪器：细胞计数设备
建议设置：手工或自动计数
核查内容：计数重复性及活率判定
仪器：图像分析软件
建议设置：ImageJ或Fiji
核查内容：记录版本和分析方法
仪器：可选活细胞系统
建议设置：温度和气体环境可控
核查内容：长时间连续成像
在记录首页填写设备型号、生产商和编号。
物镜倍率由视野覆盖范围决定：初始缺口和两侧细胞层都应清楚入镜。
采用来源明确、身份经过确认的 HaCaT 细胞，例如供应商目录号 300493 对应的细胞。
使用近期支原体检测阴性的细胞，记录传代数和复苏批次。
选择形态稳定、贴壁良好、处于正常生长状态的细胞。
避免将刚复苏、污染可疑或已出现明显衰退的培养物直接用于正式比较。
按照所在机构对人源细胞的风险评估和生物安全要求操作。
设计分组与重复
预计用时：约20分钟。
基础教学可以先只观察未处理细胞的闭合过程。
研究某种处理的作用时，至少设置相应的对照组与处理组。
组别：基础或溶剂对照
设置方式：实验培养基，必要时加入等量溶剂
主要用途：提供比较基准
组别：待测处理组
设置方式：实验培养基＋预先确定的处理条件
主要用途：观察闭合变化
组别：未划痕平行孔
设置方式：对应培养基及处理条件
主要用途：辅助观察毒性和增殖变化
组别：增殖评价平行孔
设置方式：与正式实验条件匹配
主要用途：评价增殖对结果的贡献
未划痕孔提供辅助信息，划痕本身产生的损伤仍需在正式孔中观察。
每组每轮至少安排三个培养孔。
需要形成研究结论时，建议至少完成三次独立实验，例如在不同日期使用独立准备的细胞重复操作。
每孔预先规定三个互不重叠的固定视野。
同一孔内的三个视野属于孔内取样，统计时先合并到孔水平。
确认节点：孔位、分组、视野数量和主要终点已经写入记录表。
进行铺板密度与观察窗口预实验
预计用时：约2～3天。
在24孔板中尝试每孔 1.0×10⁵、1.5×10⁵、2.0×10⁵ 个活细胞，每孔总体积500 μL。
观察接种后约24 h的覆盖程度，必要时延长至48 h。
选择能够形成均匀、连续单层的接种条件。
正式划痕时，目标为约95%～100%的均匀覆盖，并确认没有明显大片空隙或多层堆积。
方法说明通常建议在单层刚形成后开展实验，铺板密度需要针对细胞类型单独确定。
同步考察1%血清条件下24 h内的细胞形态和存活状态。
观察缺口何时明显缩小、何时接近完全闭合。
可从12 h作为主要终点、24 h作为延长观察点开始设计，最终在正式实验前根据预实验固定。
确认节点：获得适用的接种量、实验培养条件和尚未普遍完全闭合的主要观察终点。
接种正式实验用细胞
预计用时：约30～60分钟，随后培养24～48 h。
按既定传代规程制备均匀细胞悬液。
计数活细胞，并检查是否存在明显细胞团。
以每孔 1.5×10⁵ 个细胞为例，将悬液调整至：
向每孔加入500 μL细胞悬液。
每加数孔后轻轻混匀悬液，减少细胞沉降造成的孔间差异。
将培养板轻轻前后、左右移动，使细胞分布均匀。
放入37 ℃、5%二氧化碳培养箱。
培养至预实验确定的合适状态。
确认节点：各孔细胞分布均匀，计划划痕区域形成连续单层。
设置定位标记并检查细胞状态
预计用时：约15分钟。
在培养板底部外侧标记方向和孔号。
画一条与计划划痕方向垂直的细线作为定位参考，并让标记位于分析视野之外。
有电动载物台时，保存各视野坐标；手动拍摄时，结合外侧标记和载物台读数记录位置。
检查每孔单层完整性、细胞形态及培养液状态。
在划痕前按预先规定的标准标记不合格孔，例如存在大片自发脱落或明显污染的孔。
确认节点：定位方案可重复，细胞状态适合操作。
制作单条划痕
预计用时：每孔约30～60秒。
在生物安全柜内操作，保持孔中有培养液覆盖细胞。
取新的200 μL无菌吸头，使其接近垂直于孔底。
让吸头尖端轻触细胞层，沿预定方向一次平稳划过孔中央。
每孔制作一条直线划痕。
保持吸头型号、角度和操作方向一致。
以约 500～800 μm 的初始宽度作为练习目标，实际宽度以图像测量为准。
轻轻划开单层即可，避免用力刮伤培养板表面。
每孔更换新吸头。
一次划过后直接进入清洗，减少沿原路线反复修补。
确认节点：形成连续缺口，划痕外的细胞层保持完整，未见大面积成片掀起。
清除脱落细胞并加入处理液
预计用时：每孔约1～2分钟。
从孔壁一侧缓慢吸去培养液。
沿孔壁加入约500 μL预温的无钙、无镁缓冲盐溶液，轻轻晃动后吸走。
重复轻柔清洗一次。
清洗过程中保持细胞湿润，并尽快加入500 μL实验培养基。
处理组加入预先配好的处理培养基，对照组加入匹配的培养基和溶剂。
采用沿孔壁缓慢加液的方式，减少液流直接冲击划痕边缘。
清洗后观察碎屑和细胞层完整性。
仍有大量碎屑时，在预实验中统一优化清洗方法；正式比较保持一致的清洗次数和操作节奏。
确认节点：缺口内大部分游离碎屑已去除，两侧细胞层保留良好。
拍摄初始图像
预计用时：每孔约2～3分钟。
加入最终实验培养基后，立即按固定顺序拍摄初始图像，记为0 h。
逐孔记录实际拍摄时间。
选取划痕中央区域的三个互不重叠视野，避开起始端、终止端及孔壁附近。
确保每个视野都能完整看到缺口两侧边缘，并在两侧保留一定宽度的细胞层。
固定物镜、曝光、相差设置、相机分辨率和图像方向。
保存原始图像，推荐使用无损格式，例如 TIFF。
示例命名：
实验日期_组别_孔号_视野号_时间点.tif
20261001_Control_A1_F1_0h.tif
检查初始缺口面积和宽度是否符合预先确定的范围。
可以把初始宽度偏离目标值超过约20%、存在大片边缘掀起等情况作为预实验阶段拟定的技术排除条件，正式使用前固定标准。
根据初始状态作出记录，避免看到后期结果后再决定哪些图像保留。
确认节点：每孔均有三个可追踪的初始视野，图像清楚且初始缺口可测量。
连续拍摄同一视野
预计用时：每个时间点约10～20分钟，取决于样本量。
在划痕后6、12、24 h，按保存的坐标和定位标记返回相同视野。
保持与初始图像一致的拍摄参数。
记录细胞边缘形态、细胞圆缩、漂浮细胞和缺口内残留碎屑。
使用普通显微镜时，分批取出培养板，尽量缩短离开培养箱的时间。
各组采用接近的拍摄顺序和环境暴露时间。
具备活细胞成像系统时，维持规定温度与气体条件，可增加拍摄频率。
观察期内尽量保持既定培养液；需要换液时，将换液时间和方式统一纳入方案。
后期完全闭合后，该视野在该时间点的缺口面积记录为零，同时保留原图。
确认节点：各时间点能够对应到同一位置，细胞状态和拍摄条件有完整记录。
同步评价细胞存活与增殖
预计用时：按所选检测方法安排。
在平行样品中评价处理是否造成明显细胞死亡或脱落。
可采用活死染色、细胞计数或其他经过验证的方法。
需要支持迁移相关解释时，可结合增殖标记、细胞分裂计数或适当的活细胞追踪。
单纯的代谢活性读数可提供辅助信息，仍需结合形态和细胞数量解释。
使用丝裂霉素等增殖抑制剂前，验证剂量和作用时间对细胞存活、贴壁及迁移的影响，并设置相应对照。
低血清本身也属于培养条件变化，应保持各比较组一致。
确认节点：能够说明闭合变化是否伴随明显增殖差异或细胞损伤。
保存记录与结束实验
预计用时：约20分钟。
整理每孔的原始图像、定位信息、处理条件和细胞状态记录。
记录类别：细胞
必填信息：来源、身份检测、支原体结果、传代数、复苏批次
记录类别：培养条件
必填信息：培养基组成、血清批次、接种量、铺板及划痕时间
记录类别：划痕操作
必填信息：吸头型号、操作者、初始宽度、清洗方式及异常
记录类别：处理条件
必填信息：剂量、溶剂浓度、加药时间、观察期间是否换液
记录类别：拍摄
必填信息：孔号、视野号、坐标、物镜、像素标定及实际时间
记录类别：图像分析
必填信息：区域定义、面积、软件版本、分析者和排除原因
记录类别：辅助评价
必填信息：存活、增殖、死亡及脱落观察结果
按实验室生物安全要求处理细胞、废液和耗材。
在 ImageJ 或 Fiji 中打开原始图像。
根据测微尺图像或显微镜可靠的像素标定信息设置尺度。
使用 Analyze > Set Scale，输入已知长度和单位。
软件可据此将面积输出为平方微米等物理单位。
同一批图像使用相同倍率、分辨率和标定参数。
将同一视野的不同时间点图像配对。
存在小幅位置偏移时，先进行合理的图像配准，再选择各时间点共同覆盖的区域。
保持分析区域的长度、位置和面积一致。
原始图像另行保存，配准和裁剪操作保留记录。
以两侧连续细胞层的前缘为边界，勾画中央缺口。
本教程采用“连续细胞前缘之间的缺口面积”作为主要指标。
缺口内少量孤立细胞按统一规则处理，分析前固定是否将其视为已占据区域。
对初学者，建议将孤立细胞保留在前缘之间的缺口范围内，并在方法中明确说明。
所有组使用相同定义。
使用多边形或自由手绘选择工具勾画区域，再通过 Analyze > Measure 测量面积。
保存每张图对应的区域标注文件，方便复核。
自动分割时，先人工检查不同组和不同时间点的代表性图像，确认算法能够识别真正的细胞边界。
对每个视野分别计算：
例如：
则：
每个视野使用自己的初始面积作分母。
随后将同一孔三个预定视野的闭合率取平均，得到该孔的结果。
保持这一汇总方法用于全部组别和时间点。
以时间为横坐标、闭合率为纵坐标。
显示独立实验或培养孔的数据，并注明数据汇总层级。
同时保留初始缺口面积的分布，检查组间是否存在明显起点差异。
出现负闭合率时，表示当前缺口面积大于初始面积。
先检查图像位置和分割，再结合细胞脱落及边缘回缩解释。
同一孔的多个视野属于孔内取样，先汇总到孔水平。
同一孔在多个时间点被连续测量，属于重复测量。
不同日期完成的独立实验作为实验批次记录。
比较预先指定终点时，可先计算每次独立实验中各组的均值，再采用与实验设计匹配的统计方法。
分析完整时间过程时，可使用混合效应模型，考虑处理、时间及二者交互作用，并纳入孔和实验批次的相关结构。
预先设置显著性水平，例如 α = 0.05，对多重比较进行适当校正。
报告差值、置信区间及独立实验次数。
避免把同一孔的多个视野当作多个独立实验。
闭合率提高，说明在该培养和处理条件下，细胞缺口缩小得更快。
当细胞存活相近、增殖影响得到控制，并且成像显示细胞前缘向缺口移动时，可以进一步支持迁移相关的解释。
处理组出现大量圆缩、漂浮或脱落时，较慢闭合可能包含细胞损伤的贡献。
各组已经普遍完全闭合时，终点容易出现上限效应，应结合预先安排的较早时间点分析。
初始宽度差异较大时，即使按初始面积归一化，也可能保留几何条件造成的影响。
划痕实验反映二维细胞单层中的缺口闭合过程。涉及组织修复、侵袭或其他生物学功能时，需要结合相应模型验证。
常见异常包括划痕宽度不一致、边缘成片掀起、碎屑过多、视野错位、低血清后细胞状态变差，以及对照组过早完全闭合。
遇到异常时，先回看0 h图像和操作记录，再决定后续处理。
检查吸头型号、角度、施力和细胞层状态。
由同一操作者完成一轮实验，并先用额外培养孔练习。
保持单次、连续、平稳的划线动作。
重复性仍不足时，可采用标准化划痕工具或间隙形成插入件；更换方法后，重新建立基线条件。
检查细胞是否过度融合、贴壁状态是否不佳，以及划痕时是否施力过大。
降低机械冲击，统一在单层刚形成后的时间窗口操作。
需要包被的细胞，先验证包被条件，并确认划痕过程是否破坏包被层。
检查清洗方式和吸液位置。
轻柔增加预实验中的清洗充分性，避免直接冲击边缘。
正式实验锁定清洗流程，保留碎屑异常记录。
检查培养板方向、孔号和载物台坐标。
在拍摄前固定培养板放置方向，并结合外侧定位标记。
无法可靠配对的图像应标记为缺失，保留原因。
检查低血清条件的耐受性、培养液酸碱度、温度及拍摄期间的暴露时间。
在预实验中调整血清水平或缩短观察窗口。
保持细胞健康后，再讨论闭合速度差异。
根据预实验缩短主要观察时间，增加较早的拍摄点。
保持初始缺口宽度稳定，避免靠临时扩大个别划痕延长观察。
正式实验前固定时间安排。