01 SPR到底测什么
表面等离子体共振（SPR）利用金膜界面处的光学共振。多肽与表面靶蛋白结合后，近表面折射率改变，引起共振位置移动；仪器将变化记录为响应值RU。[1]
图1 典型棱镜耦合SPR原理示意，未按比例绘制。[1] 封面为概念插画，不表示真实分子结构。
RU也会响应溶剂差异和非特异吸附。因此，“出现信号”本身不能证明特异结合；必须同时检查参考表面与空白注射。[1,4]
02 从曲线读出亲和力与动力学
进样时，结合与解离同时发生；切回缓冲液后，观察已形成复合物的解离。浓度系列与合适模型配合，才能把曲线变成可解释的参数。[2,3]
图2 教学模拟，非实测数据。设定 kₒₙ = 10⁵ M⁻¹·s⁻¹、kₒff = 10⁻³ s⁻¹、Rmax = 30 RU；结合180 s，解离600 s。
公式适用于简单可逆1∶1结合；C为游离分析物浓度，Req为平衡响应，Rmax为最大结合容量。[2,3]
参数 |
告诉我们什么 |
判读边界 |
kₒₙ / M⁻¹·s⁻¹ |
结合速率常数 |
上升段还受浓度和解离影响，不能只比斜率。 |
kₒff / s⁻¹ |
解离速率常数 |
越小表示该测定条件下解离越慢。 |
KD / M |
平衡亲和力，越小通常越强 |
不同靶蛋白构建体、温度或缓冲液下慎作横比。 |
怎么选拟合方法
曲率充分、过程可分辨：用浓度系列全局拟合动力学。结合与解离快到无法可靠分辨，但能达到平衡：用Req对浓度拟合KD。未达平衡的进样终点，不能直接当Req。[2,3]
同为KD = 10 nM的教学例子 |
kₒₙ（M⁻¹·s⁻¹） |
kₒff（s⁻¹） |
τ |
肽A |
10⁶ |
10⁻² |
100 s |
肽B |
10⁵ |
10⁻³ |
1000 s |
按上述公式计算。τ是平均驻留时间；解离半衰期为ln2/kₒff。二者均不能直接等同于细胞或肿瘤滞留时间。
03 先决定谁固定在芯片上
常见起点是固定靶蛋白、让未修饰多肽流过。若改为固定肽，需验证连接位点和标签没有改变结合；流过的蛋白若是多聚体，还要警惕多价效应。[1–3,5]
测试方式 |
适合的任务 |
主要代价 |
固定蛋白 |
直接比较游离多肽与改造物的结合 |
小肽质量低，响应可能很小；蛋白固定后须保留活性。 |
固定多肽 |
肽可在非关键位点引入连接臂；作为换向验证 |
可能遮挡药效团或改变构象；多聚蛋白可桥连多个肽。 |
竞争法 |
直接响应不足，或需要验证竞争关系 |
读出依赖竞争设计与模型；IC50不能直接写成KD。 |
常见表面方案 |
怎么做 |
必须验证 |
CM5氨基偶联 |
EDC/NHS活化 → 蛋白偶联 → 乙醇胺封闭；先做pH与密度摸索 |
取向可能不均一；避免在偶联液中使用Tris等含伯胺组分。 |
SA / 生物素捕获 |
捕获生物素化蛋白或多肽；位点特异标记可改善取向 |
标记位点及标签影响；游离生物素需去除。 |
His标签捕获 |
NTA或抗His体系捕获带标签蛋白 |
捕获层脱落可叠加到解离曲线；评估缓冲液兼容性。 |
表1 方案依赖靶标与仪器，名称以Biacore常见体系为例。具体表面操作按对应芯片说明书执行。[1,5]
固定化量先算一遍
RL为固定蛋白响应，MWA和MWL分别为多肽与蛋白分子量，n为每个蛋白可结合的多肽数，factive为有效活性比例。此式为近似估算。[2]
计算例子 2 kDa多肽结合50 kDa蛋白 |
若固定蛋白500 RU，按1∶1且100%活性估算，Rmax约20 RU；活性只有50%时，约10 RU。应在可测信号与低表面密度之间找平衡，再用实测容量检验。 |
不要为追求大信号一味增加固定化量。高密度可能放大传质限制与再结合，使测得的解离变慢。[2,6]
04 一次多肽SPR测试怎么做
步骤 |
关键操作 |
1 样品核对 |
确认序列、环化与修饰、LC–MS及纯度。称重配液还需考虑盐、水和净肽含量；HPLC面积纯度不等于准确浓度。[7] |
2 缓冲液匹配 |
样品、空白与运行液的pH、盐和DMSO比例一致。确认肽在最终稀释液中可溶，并检查容器吸附与聚集。 |
3 建立表面 |
制备活性与匹配参考表面；用已知结合物确认活性。预先验证重复进样和再生后的结合容量。 |
4 预实验定范围 |
先用少量跨数量级浓度摸索。正式浓度覆盖预估KD两侧，并兼顾溶解度、背景与可测信号。 |
5 采集浓度系列 |
记录基线 → 结合 → 解离；穿插零浓度空白与重复浓度。再生或重新捕获后检查表面是否仍有活性。 |
6 校正与拟合 |
按仪器流程完成溶剂校正、参考与空白扣除。检查原始曲线、全局拟合、残差和参数稳定性，再做独立复测。 |
表2 操作框架为方法学归纳。[1–4,7] 浓度、时间和缓冲组成应通过预实验确定。
预实验起点 可溶性蛋白与单价多肽的示例 |
可先评估PBS pH 7.4、0.005% Tween-20、25 °C、30 μL/min；基线60 s、结合120 s、解离600 s。若预估KD约10 nM，可试0、1、3、10、30、100 nM，并加入重复点。上述组合是示例起点，非通用SOP。[2,8] |
DMSO单独处理
需要DMSO助溶时，先确认肽和蛋白兼容性，所有浓度保持同一最终比例。小肽响应低，细微溶剂差异就可能造成明显偏差；使用覆盖样品范围的溶剂校正系列，参考扣除不能完全替代溶剂校正。[4]
多循环 MCK |
单循环 SCK |
每个浓度独立进样；循环之间恢复表面。适合表面稳定且再生可靠的体系。 |
同一循环依次递增浓度，浓度间不再生。适合难再生体系；循环之间仍需恢复或更换表面。 |
慢解离需延长观察，快结合需确认时间分辨率；二硫键肽慎用还原剂，金属依赖体系慎用EDTA。添加剂应逐项验证，不能机械套配方。
05 先排除假象 再相信KD
看到的现象 |
优先排查 |
下一步 |
进样与停样时陡跳 |
溶剂 / 折光不匹配；也可能是快速结合 |
看原始参考曲线和溶剂校正，勿仅凭方波形状判假。 |
参考表面也明显结合 |
芯片、标签或基质上的非特异吸附 |
更换参考设计；在保留活性的前提下摸索盐和表活。 |
解离异常缓慢 |
高密度再结合、多价结合或聚集 |
降低表面密度，并比较差异足够大的流速。 |
响应远超估算Rmax |
聚集、非特异吸附；计量或分子量假设不对 |
复核样品状态、分子量、活性容量与计量关系。 |
重复进样越来越低 |
表面失活、再生损伤、样品不稳定 |
用已知结合物复测；优化再生或重新捕获。 |
表3 排查方向依据[1–4,6]。改变流速未见差异，并不足以单独排除全部传质或再结合效应。
怎样的结果值得进入SAR讨论
浓度依赖清楚，阴性对照背景可接受；残差没有明显系统趋势；参数在重复实验和合理的表面密度变化下稳定。只看R²或χ²不够，复杂模型也不能替代对异常来源的验证。[2,3,6]
文献实例 筛选命中后用复合成环肽做SPR验证 |
Linciano等在2025年的研究中，将靶蛋白氨基偶联到CM5表面，固定化量约1000 RU；测试复合成环肽，使用含2% DMSO的缓冲液，并设置溶剂校正与参考流道。这体现了展示筛选后验证游离肽的路径。[8] |
该文每条肽的SPR报告为n = 1，可作为方法实例，不能据此判断跨次实验重复性。此处未将其条件视为通用标准。
报告至少保留这些信息
蛋白构建体与标签；肽结构、纯度及浓度依据；芯片、固定化量和参考设计；缓冲液、DMSO、温度、流速；浓度及接触时间；原始与校正曲线；拟合模型、残差、重复次数和参数不确定度。
SPR解决的是测定条件下的结合问题。确认命中后，还应结合另一种合适的结合测定，以及靶点相关功能或细胞实验，判断其药物研发价值。
参考文献
[1] Cytiva. Biacore sensor surface handbook. 重点见第1章原理、第3–4章表面制备及第6章再生。
[2] Cytiva. Kinetics and affinity measurements with Biacore systems. Application guide. 2021. 重点见pp. 5–13及动力学评价章节。
[3] Cytiva. Principles of kinetics and affinity analysis. Biacore application guides. 重点见拟合、全局参数、1∶1结合及传质模型。
[4] Cytiva. Solvent correction principles and practice. 2020. CY12856-02Dec20-HB. 重点见pp. 3–5及8–9。
[5] Gomes P, Andreu D. Direct kinetic assay of interactions between small peptides and immobilized antibodies using a surface plasmon resonance biosensor. J Immunol Methods. 2002;259:217–230.
[6] Myszka DG, He X, Dembo M, et al. Extending the range of rate constants available from BIACORE: interpreting mass transport-influenced binding data. Biophys J. 1998;75:583–594.
[7] Merck / MilliporeSigma. Peptide Quick Tips. 重点见Difference Between Gross Weight and Net Weight：净肽含量与色谱纯度的区别。
[8] Linciano S, Mazzocato Y, Romanyuk Z, et al. Screening macrocyclic peptide libraries by yeast display allows control of selection process and affinity ranking. Nat Commun. 2025;16:5367. 重点见Methods中的SPR测定。
图示说明
正文示意图由药梦想绘制。图2采用简单1∶1模型生成；用于解释方法，不代表任何药物的实验结果。表格中的测试选择与排查建议为基于上述来源的研发归纳。