水凝胶流变测试与自修复评价操作指南
简要摘要
采用旋转流变仪，依次完成应变扫描、频率扫描和交替应变测试，评价水凝胶的黏弹性、线性黏弹区及受扰动后的模量恢复能力。
配合切断重接和拉伸测试，评价切口重新接触后能恢复多少承载能力。
本教程适用于已经完成制备、组成均匀、能够稳定装样的无细胞水凝胶。
采用 25 ℃ 作为基础测试温度。涉及体温条件时，将测试温度统一调整为 37 ℃，并重新确认线性黏弹区和扰动条件。
文中的尺寸、时间及质量控制阈值属于教学起始设置。正式实验前，先用独立样品完成参数筛选，再固定条件开展组间比较。
1. 引言
1.1 背景知识
水凝胶受到外力时，既能暂时储存能量，也会耗散能量。
这两种行为共同影响材料的支撑能力、形状保持和受扰动后的恢复。
在生物医学材料研究中，流变测试可以帮助你了解凝胶在小幅变形下的力学状态，以及较大扰动对其结构的影响。
仪器厂商已将振荡流变用于胶原水凝胶的批次质量评价，说明规范的装样与测试条件能够帮助识别材料之间的差异。
自修复评价还需要关注切口界面。
已有原始研究将凝胶切开、重新接触，再比较修复样品和完整样品的拉伸表现，用来评价界面重新连接后的承载能力。
本教程将这两类证据分别测量，再放在一起解释。
1.2 实验目的
确定水凝胶的线性黏弹区，选择适合后续测试的小应变。
测量不同频率下的储能模量和损耗模量，描述材料在不同时间尺度下的黏弹响应。
测定较大应变扰动后，储能模量随时间恢复的程度及多次循环后的变化。
测定切断重接后的拉伸强度恢复率，评价切口处的力学连接。
同时掌握壁面打滑、失水、过度压缩和仪器量程限制的识别方法。
1.3 实验原理
理解储能模量与损耗模量
让流变仪对样品施加周期性剪切变形，并测量应力响应。
在线性黏弹区内，可写为：
γ(t) = γ₀ sin(ωt)
τ(t) = γ₀ [G′ sin(ωt) + G″ cos(ωt)]
其中，γ₀ 为应变幅值，ω 为角频率。
储能模量 G′ 反映弹性储能部分，单位为 Pa。
损耗模量 G″ 反映黏性耗能部分，单位同样为 Pa。
损耗因子为：
在指定测试条件下，G′ > G″ 表示弹性响应占优。
这一判断需要同时注明频率、应变和温度。
理解应变扫描
保持频率不变，逐步增加应变幅值，观察模量是否变化。
在较小应变范围内，模量通常近似保持稳定，这一范围称为线性黏弹区。
超过该范围后，材料响应开始出现非线性，可能发生网络重排、软化或其他结构变化。
应变扫描能够帮助确定后续测试的工作范围。
理解频率扫描
固定在线性黏弹区内的小应变，改变振荡频率。
较低频率对应较长的观察时间尺度，较高频率对应较短的观察时间尺度。
记录 G′、G″ 和 tanδ 随频率的变化，判断材料响应的时间依赖性。
频率 f 与角频率 ω 的关系为：
ω = 2πf
因此：
1 Hz ≈ 6.28 rad/s
输入参数前，先看软件使用的单位。
我这个“参数核对碎碎念师兄”会在这里多念一句：单位核对好，后面少走弯路。
理解两种恢复指标
交替应变测试观察大幅扰动后的小应变模量恢复，得到流变结构恢复证据。
切断重接后的拉伸测试观察界面承载能力恢复，得到切口力学修复证据。
两类结果分别报告，避免让一个“恢复率”承担所有含义。
2. 材料
2.1 试剂
本实验从制备完成的水凝胶开始，凝胶原料和交联试剂按各自配方登记。
测试过程中尽量保持样品原有组成。
试剂或材料：待测水凝胶
规格与用途：配方、含水量和制备时间明确；外观均匀
来源、目录号及保存：自制样品填写配方及批次；商品样品填写厂家及目录号；保存条件按已验证制备规程执行
试剂或材料：超纯水
规格与用途：制水时电阻率18.2 MΩ·cm，25 ℃；用于水性样品的防蒸发装置及清洁
来源、目录号及保存：实验室超纯水系统；无商品目录号；当天取用
试剂或材料：原配方介质
规格与用途：仅在样品保存或湿度控制确有需要时使用
来源、目录号及保存：按实际组成登记浓度、纯度、厂家、目录号和有效期
试剂或材料：仪器核查标准物
规格与用途：仅在设备核查计划要求时使用
来源、目录号及保存：使用设备厂商认可且具有证书的标准物；记录批号、有效期及指定温度下的认证值
使用纯水填充防蒸发装置时，按设备说明书操作，保持液体与样品测试区分开。
含盐、甘油或其他共溶剂的凝胶，需要确认防蒸发环境是否引起样品吸水或失水。
本基础方案采用湿度罩或溶剂阱控制蒸发。使用封边油时，应先验证油与凝胶的相容性及其对测量的影响。
2.2 耗材
耗材：平头取样铲
建议规格：小型不锈钢或聚四氟乙烯材质
用途：转移软凝胶
耗材：刮样工具
建议规格：设备认可的塑料或软质刮刀
用途：修整平板边缘
耗材：圆片模具
建议规格：与平板直径匹配，例如25 mm
用途：制备预成型流变样品
耗材：条状模具
建议规格：约30 mm × 5 mm × 2 mm
用途：制备切断重接及拉伸样品
耗材：锋利刀片
建议规格：一次性手术刀片，配刀柄
用途：制作完整切口
耗材：平头镊
建议规格：尖端平整
用途：调整样品位置
耗材：低黏附承托片
建议规格：聚四氟乙烯片等
用途：承托修复中的条状样品
耗材：带盖湿度盒
建议规格：内置湿润材料，样品与液体分离
用途：控制修复期间的水分变化
耗材：无尘擦拭纸
建议规格：同一规格
用途：清洁仪器与工具
耗材：标尺及标签
建议规格：毫米刻度、耐水标签
用途：图像记录和样品编号
按实验室采购来源填写供应商和目录号。
涉及平板表面、夹具接触面和样品承托面的耗材，全组保持一致。
2.3 仪器设备
仪器：旋转流变仪
配置要求：支持振荡应变控制、时间扫描、频率扫描和法向力记录
核查重点：扭矩、法向力、温度、间隙及几何夹具识别
仪器：平行板夹具
配置要求：直径25 mm作为教学示例；优先使用合适的粗糙表面
核查重点：表面清洁、无损伤；按厂商要求完成间隙标定
仪器：温控装置
配置要求：可稳定保持25.0 ± 0.2 ℃
核查重点：样品区实际温度
仪器：防蒸发装置
配置要求：配套溶剂阱或湿度罩
核查重点：装配正确，避免碰触转动部件
仪器：拉伸试验机
配置要求：配低载荷传感器及软材料夹具
核查重点：力值、位移、夹持稳定性；传感器量程适合实际断裂力
仪器：尺寸测量设备
配置要求：图像测量或低接触力测厚工具
核查重点：避免压缩柔软样品
仪器：相机与计时器
配置要求：可记录切口和断裂过程
核查重点：时间同步，画面包含比例尺
旋转流变仪可参考 TA Instruments DHR-2 或具备相同测试能力的设备；该型号已有水凝胶振荡测试应用记录。(TA Instruments)
拉伸设备可参考配有适当低载荷传感器的 Instron 3342 或同等设备，相关原始研究曾用于水凝胶修复后的力学测试。(PMC)
在实验首页记录现场设备的实际型号、生产商、编号、软件版本和校准状态。
传感器选择以测量能力为准。预期断裂力很小时，优先选择能可靠分辨该力值的低量程传感器。
2.4 生物材料
使用无细胞、无组织的已成胶样品。
记录聚合物组成、浓度、交联方式、成胶时间、清洗条件和保存历史。
对于动态交联凝胶，同时记录可能影响可逆连接的酸碱度、盐浓度和温度。
优先统一“成胶结束至测试开始”的时间窗口，例如经预实验确认稳定后，固定在成胶后某一时段测试。
本教程采用物理材料测试流程。
含细胞或组织的凝胶需要另外规定生物安全、培养环境和取样后允许的测试时长。
3. 实验步骤
至少安排三个独立制备批次。
每个批次分别预留应变扫描、频率扫描、交替应变和低应变时间对照所需的新鲜样品。
应变扫描进入大应变区后，该份样品作为预实验或破坏性测试样品处理。
给后续测试另取新鲜样品，保持不同测试之间的受力历史清楚。
以直径 25 mm、间隙 1.00 mm 的平行板为例，理论填充体积为：
V = πr²h = π × 12.5² × 1.00 ≈ 491 mm³
即约 0.49 mL。
对能够塑形、适合刮样的软凝胶，每次可准备约 0.55～0.60 mL，供装样和修边使用。
每批额外预留装样练习及高应变筛选样品。
切口评价另设完整样品、切断后立即测试样品，以及修复 30 min、60 min 的样品。
为各修复时间安排相同保存时长的完整对照。
每个时间点使用独立条状样品完成破坏性拉伸。
检查夹具固定状态、温控装置和防蒸发附件。
清洁上下平板，确认表面无残留凝胶、液膜或擦拭纸纤维。
安装选定夹具，在目标温度下按照厂商流程进行零间隙或间隙校正。
完成法向力归零及设备要求的其他核查。
将温度设为 25.0 ℃，待其稳定。
核对软件中的平板直径、表面类型、间隙及应变定义。
平行板的应变随半径变化，报告时保留软件采用的边缘应变或其他定义。
将适量软凝胶放在下平板中央，轻柔聚拢，减少夹带气泡。
缓慢下降上平板，接近样品时观察法向力和边缘形态。
对可塑软凝胶，可先到达略高于目标值的修边位置，例如 1.05 mm。
用软质刮刀清除平板外多余样品，再缓慢到达 1.00 mm 测试间隙。
预成型凝胶圆片按实际厚度选择工作间隙，并建立合适的轻度接触条件。
控制压缩程度，记录最终间隙与法向力。
合适的法向力取决于凝胶强度、表面平整度和夹具条件；粗糙表面有助于减少打滑，过大的压紧力可能损伤样品。(TA Instruments)
安装防蒸发装置，静置约 5～10 min，使装样扰动和温度差逐渐减小。
在预实验中观察法向力是否趋于稳定，样品边缘是否持续收缩、渗水或被挤出。
确认稳定所需时间后，对正式样品使用一致的静置程序。
保持温度 25.0 ℃。
设置频率 f = 1 Hz，或在角频率模式下设置 ω = 6.28 rad/s。
采用对数递增的应变扫描，初始探索范围可设为 0.01%～100%，每十倍区间设置约 5 个测量点。
每个点先等待约 3 个振荡周期，再采集至少 5 个周期的数据。
结合设备软件的实际实现方式，记录稳定周期、采集周期和每点用时。
同步保存 G′、G″、实际应变、扭矩、法向力及状态标记。
极低应变处出现低扭矩报警时，将这些点标记为测量能力不足。
从信号可靠的低应变平台中选择连续稳定点，计算平台储能模量。
可预先采用“G′ 偏离平台值超过 5%”作为线性范围终点的工作判据，同时检查 G″ 和仪器状态。
这一阈值是本次实验的操作定义，应结合噪声水平确认。
选择位于稳定平台内部的小应变 γL。
例如，可靠平台延伸至约 2% 时，可考察 0.2%～0.5% 是否同时满足稳定性和扭矩要求。
确认后固定实际采用值。
继续筛选高应变 γH，使其位于明显非线性响应区，并能在短时间内引起可重复的响应下降。
若 100% 仍未产生足够扰动，可在新鲜预实验样品上逐步考察 200%、500% 等条件，同时监测样品完整性和设备能力。
高应变区的应力响应可能含有高次谐波。软件输出的模量用于描述该程序下的非线性响应时，应注明其计算方式，恢复率统一使用返回低应变后的数据计算。
重新装载新鲜样品，重复相同的温度、间隙和静置程序。
设置应变为已选定的 γL。
采用 0.1～10 Hz 的教学起始范围，每十倍区间设置约 5 个测量点。
按固定方向扫描，例如从低频到高频，全组保持一致。
每个频率先等待约 3 个周期，再采集至少 5 个周期。
在 0.1 Hz 下，一个周期为 10 s，完成上述设置约需 80 s。
把低频点时间留够，数据才有清楚的周期依据。
在预实验中确认所选 γL 在频率范围两端也位于线性响应范围，并且信号高于仪器有效测量下限。
检查高频区是否出现惯性或控制误差提示。
在仪器有效范围内报告结果，并说明实际采用的频率区间。
重新装载新鲜样品。
保持温度、平板、间隙和频率一致，频率固定为 1 Hz。
按下列程序设置三个扰动—恢复循环：
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总测试时间为：
300 + 3 × (60 + 300) = 1380 s
即 23 min。
低应变阶段可按每 3 个振荡周期输出一个数据点。
记录实际输出间隔和阶段切换延迟。
对恢复特别快的材料，增加时间分辨率前先确认仪器仍能可靠完成振荡分析。
把初始基线最后 60 s 的平均 G′ 记为 G′₀。
检查基线最后 60 s 的变化幅度。
例如，可把相对变化小于 5% 作为教学稳定性起点；具体容许范围结合设备噪声和研究目标预先确定。
观察每次高应变阶段的响应是否达到预实验所确定的扰动程度。
恢复阶段从切换回 γL 时开始计时。
保持程序连续运行，保存切换附近的原始点及状态标记。
另外取同批新鲜样品，全程在 γL、1 Hz 下测试 1380 s，作为低应变时间对照。
该对照用于观察样品老化、继续交联、失水以及持续小幅振荡带来的变化。
选择能够独立成形并适合夹持的凝胶，制备约 30 mm × 5 mm × 2 mm 的条状样品。
测量实际宽度和厚度，拍摄带比例尺的初始照片。
将样品放在低黏附承托片上，在长度方向中央制作横贯整个截面的切口。
用锋利刀片一次平稳切断，轻轻分开两部分，确认完全断开。
立即把新鲜切面对接，保持两部分轴线一致、截面充分接触。
避免重叠搭接和明显挤压变形。
本基础方案采用无外加胶黏剂、无持续外部压紧的接触修复条件。
在 25 ℃ 的带盖湿度盒中分别放置 30 min 和 60 min。
把湿润材料放在盒内独立位置，使样品与液体分开。
记录实际温度及湿度条件，并用完整对照检查是否出现明显失水或吸水。
设置同时间完整对照，以及切断重接后尽快测试的短时接触对照。
短时接触组记录切面接触到测试开始的实际时间，目标可控制在约 1 min 内。
保持每个修复时间点使用独立样品。
检查载荷传感器和夹具，完成力值归零。
选择能可靠覆盖预期断裂力的传感器，确认信号明显高于设备噪声。
将条状样品两端分别夹持，使原切口位于夹具之间的中央。
采用约 10 mm 的初始夹持间距 L₀，保持两端夹持长度一致。
轻柔移除承托片，避免在正式加载前拉伸切口。
设置横梁速度 10 mm/min 作为教学起始条件。
完整样品与修复样品使用相同速度、夹距和夹持方式。
记录力—位移数据，建议同步录像，观察夹持滑移和实际断裂位置。
条件允许时，在有效测试段设置标记，用视频跟踪标记间距。
以横梁位移计算应变时，注明其包含夹持和设备顺应性影响。
样品在装夹阶段就失去连接时，记录“无法完成装夹”及实际接触时间，单独报告这一结果。
拉伸结束后，记录断裂发生在原切口、样品本体还是夹持处。
导出仪器原始工程文件、完整数据表及测试方法文件。
保存下列信息：
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清洁夹具时，先停止运动并升起上平板。
使用与设备和材料相容的方法去除残留，保持粗糙表面的纹理完整。
把原始数据和计算结果分开保存，保留有日期的版本。
4. 数据分析与解释
4.1 数据处理
整理基础流变结果
先检查扭矩、实际应变、温度及仪器状态，再选择有效数据范围。
保留无效点及原因标记，图中采用预先规定的方式处理。
分别绘制应变扫描、频率扫描和交替应变时间曲线。
在图注中写明平板直径、间隙、温度、频率和应变设置。
计算相对于初始基线的恢复率
设初始基线最后 60 s 的平均储能模量为 G′₀。
第 n 次扰动后，恢复至时间 t 的储能模量为 G′ₙ(t)。
计算：
建议预先指定 30 s 和 300 s 两个评价时点。
采用固定窗口求均值，例如 30 s 指标使用 24～36 s 的数据，300 s 指标使用 270～300 s 的数据。
所有组使用相同窗口。
同时保留完整恢复曲线，便于观察恢复速度和后期变化。
计算每次循环的局部恢复率
把第 n 次扰动前低应变阶段最后 30 s 的平均模量记为 G′pre,n。
计算：
初始基线归一化反映多次循环后的累积变化。
局部归一化反映本次扰动后，相对于本次扰动前的恢复程度。
两个分母各有用途，图中写清楚就好啦。
使用示例核对计算
以下为教学示例：
G′₀ = 1000 Pa
第一次恢复 300 s 时：
G′₁ = 850 Pa
则：
R₁(300) = 85%
第二次扰动前为 850 Pa，第二次恢复后为 800 Pa。
相对于初始基线：
R₂(300) = 80%
相对于第二次扰动前：
这组结果表示第二次局部恢复较高，同时相对于最初状态仍存在累积下降。
报告恢复时间
将首次恢复到 0.90G′₀，并维持至少连续三个有效数据点的时间定义为 t₉₀。
该判据需在分析前确定。
在 300 s 内未达到时，报告“观察窗口内未达到初始模量的90%”。
首次有效数据点已经超过该阈值时，报告“恢复时间小于或等于首次有效采样时间”。
计算切口力学修复率
按样品初始截面积计算工程应力：
其中：
A₀ = b × h
b 为宽度，h 为厚度。
采用每条样品的实际尺寸计算，单位保持一致。
将修复样品最大工程应力与同批、同保存时间完整样品的最大工程应力比较：
例如，修复样品为 12 kPa，完整对照为 20 kPa，则：
ησ = 60%
单独报告断裂应变及断裂位置。
需要评价韧性恢复时，对相同定义的应力—应变曲线积分，并另列指标名称。
4.2 统计分析
以独立制备批次作为主要重复单位。
同一份样品上的三个扰动—恢复循环属于重复测量。
同一批次制作的多条试样属于批内重复，报告时写明批次数和每批试样数。
显示各独立批次的数据点，同时报告均值和标准差。
比较两种材料在预先指定循环、指定恢复时点的表现时，根据样品是否成对以及数据分布选择相应检验。
同时比较材料与循环次数时，可采用混合效应模型，将材料、循环及其交互项作为固定效应，将批次或样品作为随机效应。
比较多个修复时间时，考虑同一批次提供多个时间点样品所带来的相关性。
预先设置显著性水平 α = 0.05，对多重比较进行适当校正。
同时报告差值与置信区间，结合仪器重复性判断差异的实际意义。
4.3 数据解释
在有效测试范围内，G′ > G″ 支持材料呈弹性占优的黏弹响应。
高应变扰动后，低应变 G′ 逐渐恢复，支持材料具有该条件下的流变结构恢复能力。
完整对照随时间持续增硬时，考虑继续交联、老化或水分变化对恢复率的贡献。
恢复率超过 100% 时，保留结果并结合时间对照解释。
切口重新接触后，拉伸强度随修复时间提高，支持界面承载能力逐渐恢复。
样品在原切口以外断裂时，说明本次测试中原切口未成为最先失效的位置；仍应结合整体强度和断裂应变评价恢复程度。
切口外观变淡、颜色扩散和能够被提起，可以作为形态观察结果。
对具体可逆键或分子重组机制的判断，还需要与相应化学或结构证据结合。
比较不同材料时，固定相同高应变是在比较同等外部扰动下的表现。
为不同材料分别选择相近扰动程度，则是在比较相近受损状态下的恢复表现。
在方案和图注中明确采用哪一种比较方式。
5. 故障排除
5.1 常见问题
重点关注低应变数据噪声大、模量突然下降、恢复率异常升高、重复性差，以及切口拉伸时发生滑移或夹持破坏。
出现异常时，先查看仪器状态和样品外观，再进行材料解释。
5.2 解决方案
低应变下模量剧烈波动
检查扭矩是否低于有效测量范围，实际应变是否达到设定值。
在线性范围允许的前提下适当提高工作应变，或使用更适合弱信号的夹具和仪器配置。
重新确认参数后，全组采用一致的测量条件。
模量突然“跳水”
检查样品边缘是否开裂、甩出，法向力是否突然变化。
观察样品是否在平板表面滑动。
换用适合的粗糙平板，并在新鲜样品上复测。
通过不同间隙或表面条件的预实验辅助识别接触问题，同时控制压缩状态。
模量随时间持续升高
检查防蒸发装置、边缘干燥和温度稳定性。
与低应变时间对照比较，判断继续交联和材料老化的可能影响。
对制备后持续变化的凝胶，统一样品龄期，并预先规定可接受的基线漂移。
高应变阶段响应变化很小
回看应变扫描，确认 γH 是否进入有效非线性区域。
在新鲜预实验样品上调整幅值或作用时间。
若安全、可靠的测量范围内始终难以形成预期扰动，应报告该程序的适用限制，并重新选择损伤评价方式。
恢复速度快得只剩一个点
检查采样间隔、单点周期数和切换延迟。
提高时间分辨率时，同时确认信号质量。
把最快可分辨时间写入结果，按实际采样能力报告恢复速度。
切口看似连接，装夹时又分开
检查切面是否充分接触、修复环境是否引起干燥，以及承托片移除时是否施加了额外拉力。
统一切断到重接的间隔，轻柔承托至夹持完成。
把装夹失败数量和条件一并记录，用于评价方法适用性。
拉伸时总在夹具旁断裂
检查夹持压力、夹具边缘和样品厚度。
采用适合软材料的夹持方式，在夹持区增加经验证的保护垫片，并保持所有组一致。
对原切口修复的评价，优先使用无明显滑移、有效测试段内失效的曲线；夹持区破坏的数据保留异常标记，按预先规定的有效性标准处理。