反刍动物的胃肠健康与消化道微生物组息息相关。然而，对于紧贴宿主肠道内壁的上皮细胞层的微生物知之甚少。它们直接与宿主细胞“对话”，调控营养吸收与免疫平衡，但传统的宏基因组测序方法因高达99%以上的宿主DNA污染，难以窥其全貌。
近日，凌恩生物客户——南京农业大学毛胜勇团队在《Genome Biology》（Q1，IF=9.4）发表文章，通过稀释宏基因组首次揭示了奶牛胃肠道上皮附着微生物组的完整基因组图谱与功能。
1、样本：12头健康荷斯坦奶牛的10个胃肠道区域（包括瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃及各肠段）上皮样本，共计120份。
2、测序：对所有样本同时进行稀释宏基因组测序和常规宏基因组测序
3、分析：构建牛全胃肠道上皮微生物基因组图谱（MGA-GE）。分析微生物、病毒群落结构、多样性、生态位、次生代谢物、丁酸弧菌的泛基因组。
1、前处理：2g上皮组织在10ml冰冷的1×PBS中匀浆、震荡，4℃、500×g 的速度离心5min，上清液转移到新的试管中，并在4℃下以17，000×g 的速度离心 5min以收集微生物细胞，所得沉淀用于进行DNA提取；
2、梯度稀释，通过qPCR检测样本中宿主核酸，确定最终稀释倍数为1000倍。
3、建库测序
微量建库，NGS测序，普通宏基因组：27.4G/sample；稀释宏基因组：14.4G/sample。
1、构建MGA-GE
本研究组装获得 442 个高质量MAG和 1465 个中质量MAG。其中，95%的MAGs是由稀释宏基因组获得。获得5,603 vOTU，33.2% 完整病毒基因组，18% 高质量，48.8% 中等质量，其中，瘤胃、回肠、空肠病毒丰度最高。
图1 奶牛胃肠道上皮微生物基因组图谱的构建
2、MGA-GE的分类和群落结构
使用 GTDB 数据库对原核生物的 MAG 进行了分类学分类。在987个菌株水平的基因组中，62.8%是无法在物种水平分类的新类群，表明上皮生态位中存在大量未被探索的微生物多样性。上皮组织病毒高度新颖性，49.1%的病毒基因组与已知病毒无显著相似性。
图2 奶牛胃肠道上皮MAG的系统发育关系及分类
3、MGA - GE的系统基因组多样性和生态位特化
上皮组织微生物具有显著的生态位分化，与消化道微生物仅5.6%为两者共享。MGA - GE具有空间异质性，在胃肠道不同区域差异分布。与消化道病毒相比，上皮病毒在分类上更难以界定，且表现出更高的跨属感染潜力，这可能促进了上皮微生物间的基因交换和适应。
图3 胃肠道上皮和内容物微生物多样性的比较
4、胃肠道上皮相关微生物群中次生代谢物的生物合成潜力
使用antiSMASH从MAGs中预测到1,200个生物合成基因簇（BGCs），其中75.1%在MIBiG数据库中无同源序列，表明具有巨大的生物合成新颖性。这些90.8%的BGC主要富集于前胃上皮，表明该区域是抗菌/信号化合物生产的“热点”。
图4 BGCs在MGA-GE数据集中被识别
5、胃肠道上皮的微生物代谢专门化和功能可塑
MGA-GE中，40.4% 的基因在 eggNOG没有注释到，表明存在大量未被表征的功能潜力。与消化道非冗余基因比较，发现51.9% 的基因是上皮细胞特异性，其中，丁酸弧菌、普雷沃氏菌和RUG099是独特基因的主要贡献者。研究共鉴定到1,212个病毒编码的辅助代谢基因（AMG），主要富集于氨基酸代谢和能量代谢，推测病毒通过AMG来影响上皮微生物的代谢网络，帮助其适应营养稀缺的环境。
图5 胃肠道上皮微生物组的功能景观和群体内基因组变异分析
6、新型丁酸弧菌菌株显示出不同的底物利用偏好和丁酸盐产量
消化道分离培养的丁酸弧菌、宏基因组binning得到的丁酸弧菌以及本次上皮组织binning得到的丁酸弧菌，共同构建进化树，发现上皮组织中的丁酸弧菌单独分支。进一步分析发现它们通过丢失经典途径、获得利用氨基酸衍生底物合成丁酸的替代途径，实现了对上皮生态位的独特适应。
图6 新型丁酸弧菌分支在瘤胃上皮中不同的代谢偏好
本研究通过稀释宏基因组测序首次构建了奶牛胃肠道上皮附着微生物组的完整基因组图谱与功能。为其他宿主污染严重的样本提供新的分析方法。稀释宏基因组更多细节请联系我们：13032137192，凌恩生物，欢迎来电~
参考文献
Genome-resolved metagenomics uncovers diversity and functional landscapes of the gastrointestinal epithelium-associated microbiome in cattle.Genome Biology,2026.
原文链接
doi.org/10.1186/s13059-026-03960-z
