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编辑 | 周慧嘉

审核 | 王紫嫣

摘要

本期给大家分享一篇华盛顿大学Institute for Protein Design/Baker Lab发布在预印本上的文章，题目是："RFOptimization: Guiding Design Optimization with All-Atom Structure Prediction"。

近年来，RFdiffusion等生成式模型已经可以从头设计蛋白binder，但真正进入后续实验的候选仍然很少。一个典型流程往往需要先生成成千上万甚至更多设计，再用结构预测模型进行严格筛选；大量候选并不是完全错误，而是处在筛选阈值附近，最终因为iPAE、iPTM或局部几何指标差一点而被直接丢弃。RFOptimization（RFO）针对的正是这一类“borderline designs”。它并不重新训练一个生成模型，也不从头搜索整个蛋白空间，而是把已有设计当作起点，在局部序列空间里做residue-wise mutation search：一条分支利用RoseTTAFold3（RF3）的梯度信息直接指导氨基酸突变，另一条分支用独立的结构预测模型Boltz重新预测结构，再通过ProteinMPNN / LigandMPNN 做结构条件下的序列重设计。

最终，RFO希望实现的并不是“生成更多”，而是“把已经生成出来但差一点过线的候选救回来”。作者进一步用未参与优化的AlphaFold3作为held-out evaluator，并在RF3、Boltz、AF3三模型共识标准下评估，以降低对单一结构预测模型过拟合的风险。

研究背景

当前de novo protein design的一个核心瓶颈并不只是“能不能生成结构”，而是生成之后的有效率。以RFdiffusion为代表的扩散模型可以快速产生大量 backbone 或复合物候选，但真正通过严格in silico filters、值得进入实验验证的比例仍然较低。

另一方面，BindCraft、BoltzDesign1、HalluDesign、Protein Hunter等方法展示了另一条路线：直接利用结构预测模型的confidence landscape来反向优化序列。不过，这类方法很多更偏向from-scratch generation；如果一个已有设计已经具有较好的整体拓扑和结合模式，仅仅因为几个残基、局部界面或几何关系不够理想就被放弃，会造成大量计算浪费。

因此，本文试图解决的问题可以概括为：能否把全原子结构预测模型本身变成一个“局部序列优化器”，在几分钟内对已有候选做少量突变，从而提高最终filter-passing rate，同时尽量避免优化结果只对某一个predictor有效？

模型架构

1.两条互补的优化分支：Gradient-guided MCMC + Structure Cycling

RFO 是一个training-free、模块化的优化框架。每个外层optimization cycle中，系统会在两类mutation move之间进行选择：RF3 gradient branch 负责目标导向的局部修改，Boltz cycling branch负责基于独立结构假设的序列重新采样。论文默认两条分支以相同概率被选择。

Gradient branch：通过RF3的可微信心头和distogram head，把用户定义的目标函数对输入序列求梯度，再据此提出离散氨基酸突变。
Cycling branch：使用Boltz对当前序列重新进行全原子结构预测，再用ProteinMPNN或LigandMPNN对可设计位置做inverse folding，得到与预测骨架相容的新序列。

gradient branch更擅长沿着明确目标做“精修”；cycling branch则提供来自另一套predictor的结构假设和更广的序列探索，两者交替可以减少陷入单模型局部最优的概率。

图 1 RFOptimization总体框架：从已有complex 出发，在gradient-guided MCMC 与cycling 两条分支之间交替优化。

2.如何绕过 RF3 diffusion 的不可微问题？

RF3的全原子坐标由diffusion module逐步去噪生成，如果直接穿过整个扩散过程反向传播，计算代价很高。RFO的做法是对diffusion module使stop-gradient，不通过采样坐标本身求梯度，而是从Pairformer trunk 上连接的confidence head和distogram head构建可微objective。

因此，梯度路径可以被理解为：objective→confidence/distogram →Pairformer→residue-type input。每次提出突变后，RFO都会把序列重新投影为真实的离散氨基酸序列，并重新执行RF3 featurization，使原子类型、连接关系和参考坐标与当前残基身份保持一致，而不是让序列停留在连续松弛空间中：

L_total = Σₖ λₖ Lₖ

其中不同的Lₖ可以来自confidence、distogram proxy或原子级几何约束。比如binder benchmark中主要使用mean interface PAE作为优化目标：

L_iPAE = Mean { Eᵢⱼ : Mᶦⁿᵗᵢⱼ = 1 }

这里Eᵢⱼ表示RF3给出的expected predicted aligned error，Mᶦⁿᵗ 用于选出跨链interface pair。因为RFO统一最小化loss，所以更低的interface PAE对应更高的复合物相对定位置信度。对于酶设计，则可以把pLDDT与特定催化原子之间的距离约束组合在同一个目标函数中。

3.GradMCMC：不是只接受“变好”的突变

如果每一步都贪心地选择当前最优突变，很容易卡在局部极小值。RFO因此把梯度引导与Metropolis-style MCMC结合：如果新序列使loss降低，就直接接受；如果loss暂时升高，也允许以温度相关概率接受，从而在优化早期保留探索能力。

ΔL = L(s′) − L(sᵗ)

P_acc = exp[ −ΔL / max(Tₜ, 10⁻¹⁰) ] (当 ΔL ≥ 0)

Tₜ = T₀ · 2⁻⁽ᵗ⁻¹⁾⁄ʰ

补充材料中的默认设置为T₀= 1.0、temperature half-life h = 40；随着温度逐步降低，搜索策略会从早期“允许跳出局部区域”逐渐转向后期的局部精修。默认的GradMCMC单次 proposal 最多改变1个氨基酸。

图 2 RFO 的mutation proposal pipeline：上方为RF3 gradient-guided mutation，下方为structure prediction + MPNN cycling。

4.可自定义 objective：从 binder confidence 到原子级催化几何

RFO的另一个特点是 objective-oriented。用户不需要为每一种设计任务重新训练模型，而是直接定义“想优化什么”。论文将目标大致分成三类：

Confidence-based loss：例如 mean iPAE、pLDDT 等，用于提高模型对结构或界面的预测置信度。

Distogram-based proxy：例如跨链接触、链内接触和 interface distance entropy，用预测距离分布提供可微信号。

Atom-level geometric constraints：直接约束任意原子对之间的距离，适用于 enzyme active site、金属配位或共价相互作用等需要精确几何控制的任务。

这使得同一个优化框架可以覆盖 protein–protein binder、cyclic peptide、small-molecule binder 以及 active-site-aware enzyme design，而不需要为每一种任务重新训练专门的生成模型。

实验结果

1.Protein–protein binder：平均成功率从 6.73% 提升到 22.31%

作者首先在13个此前用于binder design benchmark的蛋白靶点上测试RFO。初始候选由RFdiffusion生成，优化目标采用mean-iPAE；优化后再用未参与梯度或cycling的AlphaFold3独立refold，并以iPAE< 2.5、iPTM > 0.8作为最终通过标准。在最多10个optimization cycles后，平均成功率从6.73% 提升到22.31%，约为原来的3.3倍。部分靶点提升尤其明显：PDGFR 从17.5% → 50.0%，PD-L1从10.0% → 40.75%，FGFR2从0% → 28.0%，PD1从0% → 27.5%，VirB8 从0% → 27.25%。

2.Cyclic peptide：1.25% → 12.57%，约 10.1 倍提升

在GABARAP、MCL1、MDM2 和 RbtA四个cyclic peptide target上，起始scaffold来自 RFpeptides。相同的AF3 filter下，平均成功率从1.25%提升到12.57%。其中GABARAP从0%提升到24.12%，MCL1从0%到10.25%，MDM2 从3.75%到10.25%，RbtA从1.25%到5.63%。作者指出，不同target的提升幅度并不一致，说明 RFO并不是对所有pocket都能同样容易地优化；例如具有明确疏水LIR-binding groove的GABARAP在几何上更容易被局部优化。

3.Enzyme / atomic motif：同时优化全局折叠与催化几何

在24个atomic motif enzyme（AME）target上，RFO使用一个composite objective：一部分是催化残基之间的原子级几何约束，另一部分是结构置信度项。优化后24个target中有18个的composite fitness得到改善，同时所有24个target 的predicted substrate confidence都随优化提高。这部分实验体现了全原子模型的优势：优化对象不只是“这个蛋白像不像能折叠”，还可以直接指定“某几个催化原子之间应该保持什么距离”，让局部活性位点几何与整体scaffold quality同时进入搜索目标。

图 3 RFO 的in silico benchmark结果

4.三模型共识：降低“只会讨好一个 predictor”的风险效应

结构预测模型反向优化的一个常见风险是model hacking：序列可能只是学会提高某个predictor的confidence，而不是真正变得更可靠。RFO为此用RF3提供gradient、Boltz提供cycling，而AF3从不参与优化，只在最后作为独立evaluator。

在更严格的RF3 + Boltz + AF3三模型consensus criterion下，只有三个模型都同时满足iPAE<2.5和iPTM>θ才算通过。

当θ=0.8时，完整RFO的consensus success rate为12.08%；cycling-only 为7.50%，gradient-only 为6.67%，Protein Hunter为 7.50%。

这说明两条分支组合后的提升能够更好地跨predictor保留下来。

5.计算效率：约 26 GPU-min 得到一个 consensus-passing design

在13个PPI target 上，作者进一步比较了获得一个通过三模型 consensus filter的设计所需的摊销GPU时间。在单张A100 上，RFO平均约26分钟得到一个通过候选；Protein Hunter 约为178分钟；论文给出的BindCraft对比约为 34 GPU-hours。

这也是本文最核心的工程意义之一：不是依赖更大规模的全局采样，而是把计算预算集中在已有候选附近做 targeted local optimization。主文报告单次RF3 优化迭代约需要45–60秒，通常1–10个iteration 就能看到明显改善。

讨论

首先，这篇工作的所有benchmark 都是in silico结果，目前并没有提供 wet-lab binding affinity、activity或实验成功率。因此，“通过AF3 /consensus filter”不能直接等价为“实验上一定能结合或有功能”。RFO 更准确的定位是提高计算筛选阶段的候选质量和效率。

其次，RFO是局部优化框架，它依赖起始seed的质量。如果初始backbone、binding pose或active-site topology本身已经非常差，少量residue mutation未必能够把它带到完全不同的结构区域。论文也明确把底层structure predictor的准确性和initial design quality列为当前限制。

另外，一个容易忽略的实现细节是：主文把iPTM列在可用confidence metrics中，但补充材料指出当前软件实现中的iPTM会被转换成Python scalar，因此目前并不是gradient-bearing objective。写代码或复现实验时，需要区分“模型能够报告的metric”和“真正参与反向传播的loss”。

从方法学上看，RFO更像是在protein design pipeline中增加了一个“refinement layer”：上游模型负责探索更大的结构空间，RFO则负责对筛选边界附近的候选进行快速、可定制的序列修补。未来如果上游生成质量和全原子预测模型继续提升，这类局部优化方法的价值可能会进一步放大。

论文

原文：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.04.749184v1

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