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目前在植物发育、非生物胁迫研究领域已经产出大量高水平单细胞图谱成果，但在植物-植食性昆虫互作方向，将时间序列单细胞转录组与空间分辨代谢组开展深度整合的研究案例仍然稀缺。
烟草既是重要经济作物，也是研究植物抗虫次生代谢的经典模式材料。该研究以烟草叶片遭受斜纹夜蛾取食胁迫为研究体系，耦合时间梯度单细胞转录组与空间代谢组技术，为作物生物胁迫多组学整合研究提供研究范本，同时为烟草抗虫分子育种提供可落地的候选基因资源。
奥智团队为本研究提供单细胞转录组测序与生物信息分析服务。
● 发表期刊：Journal of advanced research(IF=17.1)
植食性昆虫是造成全球农作物产量与品质损失的关键生物胁迫因子。植物进化出组成型防御 + 诱导型防御的多层防御体系，防御反应依赖多种细胞类型在时间-空间维度协同调控。传统 bulk RNA-seq（混合组织转录组）输出的是组织水平平均信号，掩盖组织内部的细胞异质性，难以区分不同细胞类群在信号感知、信号级联传递、次生代谢重编程过程中的分工，制约植物-昆虫互作机制解析以及抗虫靶点挖掘。
烟草叶片单细胞图谱解析植食胁迫诱导的细胞重塑与转录时序重编程
整合 4 个时间梯度的单细胞数据集，共获得 28,318 个高质量细胞；经无监督聚类得到 15 个细胞簇。结合标记基因数据库（PCMDB、scPlantDB）、GO（基因本体）富集分析、RNA 原位杂交验证，将细胞注释为：叶肉细胞（MC）、表皮细胞（EC）、保卫细胞（GC）、木质部细胞（XC）、韧皮部伴胞细胞（PCC）、晚 S 期细胞（LSP）、G2/M 期细胞（G2MP）以及身份未表征细胞（UC）。
植食胁迫处理后叶片细胞组成发生重塑：表皮细胞、维管相关细胞占比上升，叶肉细胞占比下降。该结果说明，面对昆虫取食，植物优先强化表皮物理屏障，同时调动维管组织完成防御相关物质的转运与资源分配。
对 3,867 个跨时间、跨细胞表达的基因开展 mfuzz 软聚类，划分得到 6 个时序表达模块。模块 1-3 的基因在胁迫处理后表达下调，功能富集光合作用、能量代谢通路；模块 4-6 为胁迫诱导上调模块，分别对应早期茉莉酸（JA）介导抗性与次生代谢合成、中期活性氧稳态调控、后期组织损伤修复。
不同细胞类型应答胁迫存在时序分化：叶肉细胞、表皮细胞、保卫细胞主要在处理后 1 hpt（hours-post-treatment，处理后小时）早期阶段响应；维管细胞响应高峰延后至 3 hpt。基于上述时序差异，作者提出烟草抗虫的双阶段防御范式：叶肉、表皮、保卫细胞作为前线感知单元快速启动早期防御反应，维管细胞更多参与中后期稳态修复与防御资源重新调配。
时间分辨空间代谢组揭示防御代谢物组织特异性分布与激素依靠维管系统完成系统传递
时间序列 MALDI-MSI（基质辅助激光解吸电离质谱成像）空间代谢组一共检测到 1,953 种代谢物，其中 1,431 个代谢物达到质谱一级鉴定置信水平。植食胁迫驱动的代谢重编程具备强烈的时空-组织异质性，表皮、维管束的代谢物动态变化幅度显著高于叶肉组织。
茉莉酸（JA）、12-羟基茉莉酸在未受胁迫样本中主要富集于表皮；昆虫取食胁迫发生后，激素发生重新分配，向维管组织、叶肉细胞转运。质谱成像结果在组织层面佐证：表皮是防御激素的早期积累位点，维管系统介导防御激素长距离转运，实现系统性防御信号扩散。 不同防御代谢物存在明确的组织偏好：异樱花素、1,3-二咖啡酰奎宁酸主要积累于表皮；尼古丁-N-氧化物优先富集在叶肉和维管组织。
注：原文明确技术局限：受仪器分辨率限制，本研究的空间代谢组仅可区分表皮、叶肉、维管三大组织层级，尚无法实现单细胞分辨率，因此不能直接和单细胞转录组开展逐细胞水平的关联分析。
细胞通讯与表皮亚群共表达网络揭示表皮细胞在防御信号网络中的中枢地位
基于 PlantPhoneDB 数据库，借助拟南芥同源基因注释烟草的配体-受体（LR）对，解析胁迫条件下细胞-细胞通讯网络的动态变化。昆虫取食后细胞间预测互作总数量显著升高，互作强度在 1 hpt~3 hpt 达到峰值；信号枢纽随时间发生时序转换：1 hpt 保卫细胞为主要信号输出节点，3 hpt 表皮-木质部细胞之间通讯交互显著增强，凸显表皮在防御信号级联放大过程中的核心作用。
将表皮与保卫细胞从整体数据集提取后开展亚群重聚类，得到 13 个表皮相关亚群；通过 hdWGCNA（高维度加权基因共表达网络分析）识别得到 7 个细胞亚群特异性共表达模块。其中绿色模块和 1 hpt 早期防御响应高度相关，富集茉莉酸信号通路、萜类次生代谢生物合成通路；棕色模块与 3 hpt 中期应答关联，主要富集活性氧（ROS）代谢通路。
绿色模块调控网络包含茉莉酸合成关键基因（AOC3、JAO2、JAZe）、钙信号基因、MAPK 级联激酶基因；网络核心位置挖掘得到一批转录因子：WRKY81、WRKY70、WRKY53、MYB94、ERF4，提示 WRKY81 是介导表皮早期抗虫应答的关键候选调控因子。
表皮细胞拟时序轨迹证实 6 号表皮亚群为植食胁迫早期应答功能亚群
植食胁迫处理之后，表皮 6 号亚群细胞占比发生显著扩张，提示该细胞亚群发生细胞状态重编程，参与防御程序的激活。 利用 Monocle2 开展拟时序轨迹重构，4 个关键表皮亚群形成完整分化轨迹：细胞起源来自 0、1 号表皮亚群，分化走向两个终端命运；细胞命运 2 对应 6 号表皮亚群，差异基因显著富集茉莉酸介导抗性、苯丙烷类物质生物合成通路；细胞命运 1（7 号亚群）更多参与水分稳态、离子转运等基础生理过程。
WRKY81 家族 4 个同源基因在向细胞命运 2 的分化路径上持续上调，在单细胞状态层面建立该转录因子家族和表皮早期防御程序激活的关联。
VIGS 功能验证证实 WRKY81 是烟草早期抗虫防御必需转录因子
Nta17g07590 是 WRKY81 家族中受胁迫诱导上调最显著的拷贝；时间维度上该基因在 1 hpt 即可快速被诱导；细胞层面主要表达在 0、1、6 号早期应答表皮亚群，符合早期防御调控因子的表达特征。
利用 VIGS（病毒诱导基因沉默）技术构建 WRKY81 沉默植株，qRT-PCR 验证靶标基因转录敲降效率；开展斜纹夜蛾幼虫饲喂实验，测定 RCR（相对消耗率）、RMR（相对代谢率）评价昆虫取食性能。结果表明：取食 WRKY81 沉默植株叶片的幼虫，RCR 与 RMR 显著高于野生型对照。证明抑制 WRKY81 会削弱烟草抗虫能力，提升害虫取食与营养同化效率；WRKY81 是烟草早期抗虫应答不可或缺的转录调控因子。
该研究耦合时间序列单细胞转录组与空间质谱代谢组，实现转录-代谢、时间动态-组织空间分布的多维度解析，证实植物抗虫防御是多细胞类型时序化、空间化协同完成的复杂调控网络。该工作突破 “表皮仅作为物理屏障” 的传统认知，证实表皮细胞是昆虫取食信号的早期感知与信号放大枢纽；表皮 6 号亚群是启动早期抗虫防御程序的关键功能细胞群体。结合生物信息挖掘与 VIGS 体内基因沉默功能验证，鉴定关键转录因子 WRKY81，为烟草以及其他经济作物抗虫遗传改良提供候选基因资源。
未来，sc/snRNA-seq、空间转录组、MALDI 空间代谢组、单细胞 ATAC-seq 多技术联合，实现染色质-转录本-代谢物多层分子信息的对应解析，将成为解析植物生物胁迫、次生代谢调控的主流研究路径。
奥智生物深耕植物单细胞与空间代谢技术服务，积累大量非模式作物项目经验。针对烟草、林木、药用植物这类细胞壁复杂、次生代谢丰富的难处理样本具备成熟的实验优化方案；可提供从实验设计、上机测序到多组学联合解析的一体化服务。
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