视神经病变以视网膜神经节细胞（RGC）进行性死亡、视神经退变为核心特征，是不可逆失明的重要诱因，同时与阿尔茨海默病、多发性硬化等中枢神经退行性疾病高度关联，目前缺少有效的神经保护与再生临床方案。
腺相关病毒（AAV）基因治疗是RGC保护的重要策略，但CAG、CMV等广谱启动子会在视网膜多种细胞广泛表达，脱靶风险高、副作用不可控。如何实现视网膜神经节细胞（RGC）的精准靶向，成为突破临床应用的核心关键！
今天为大家解读一项重磅研究：Mouse γ-Synuclein Promoter-Mediated Gene Expression and Editing in Mammalian Retinal Ganglion Cells。研究团队筛选出小鼠γ-突触核蛋白（mSncg）特异性启动子，并以此构建RGC靶向AAV工具箱，已拓展至基因编辑、外源基因过表达和在体钙成像等应用，为视神经病变的精准基因治疗带来全新方案。
研究团队以AAV2为载体，通过体内外双重验证，对比不同启动子的RGC靶向能力，锁定最优靶向方案：AAV2+mSncg启动子+玻璃体腔注射。
01.体内小鼠实验：mSncg启动子特异性拉满
评估不同启动子RGC靶向能力，广谱启动子在神经节细胞层（GCL）及内核层（INL）均有表达；而mSncg启动子驱动的荧光信号，几乎完全局限于神经节细胞层，精准锁定目标RGC细胞。
图1.不同启动子调控EGFP在小鼠视网膜中的层特异性表达
双重标记实验佐证靶向效果：
-免疫组化检测：78%的RGC可被高效转导，85%的表达细胞为特异性RGC（图2A、B）。
-上丘（SC）DiI逆行标记：75%的投射RGC被成功靶向表达EGFP（图2C、D）。
图2.利用RBPMS免疫标记与DiI逆行追踪，共识别小鼠视网膜中AAVmSncg EGFP阳性RGC，共同标记效率达到80%以上。AAV-mSncg-EGFP病毒的递送量为3E+9vg/eye。
02.体外人源细胞验证：完胜人源同源启动子
研究在hPSC分化来源RGC（已整合Brn3b:tdTomato）、人原代RGC及人干细胞分化RGC中对比验证，小鼠mSncg启动子的转导效率显著优于hSncg（图3A-C），完美解决人源启动子表达偏弱的难题。
图3.验证AAV-mSncg-EGFP在不同来源人RGC中的转导效率
基因治疗的核心诉求之一，就是长效稳定表达。研究通过活体激光检眼镜（SLO）长期动态监测，对比mSncg与传统CAG启动子的表达模式：
-mSncg组：注射后4周表达达到峰值，短暂下调后自3个月持续回升，稳定高效表达直至12个月（图4A-C）。
-CAG广谱组：表达强度整体偏弱。
图4.小鼠RGC中mScg或CAG启动子驱动的长期EGFP表达
AAV病毒载体包装容量有限（约4.7kb），缩短启动子可以容纳更大外源基因。将1.45 kb全长mSncg从5’端截短获得1.03 kb、0.66 kb、0.27 kb三种变体（图5A）：
①所有截短变体均保留接近全长的RGC启动活性（图5B–D）
②截短程度越高，内核层非特异性荧光越多，RGC靶向特异性逐步下降（图5E），证明启动子上游序列是维持细胞特异性的关键。
图5.小鼠RGC中不同截断型mScg启动子的特异性和效力
01.双靶点精准编辑，阻断RGC双重退变通路
视神经损伤退变分为两大独立通路：Ddit3基因：介导内质网应激，诱发RGC胞体凋亡；Sarm1基因：主导视神经轴突退变断裂。二者作用相互独，双基因同步靶向是最优治疗思路。
使用0.27 kb 截短 mSncg 启动子包装 SpCas9，全长mSncg驱动Cre；联合 AAVU6CHOP/SARM1 gRNAs，分别在野生型小鼠和LSLFlagSpCas9工具小鼠开展验证：
①可在 RGC 成功表达 Cas9，有效下调Ddit3（CHOP）、Sarm1（图6A、B）。
②原位杂交 + 免疫染色证实内源性 Ddit3、Sarm1 被敲低，损伤诱导基因上调后，敲低效果更加显著（图6C、D）。
图6.AAV-mSncg-CRISPR/Cas9介导小鼠RGC中Ddit3与Sarm1基因敲低
02.模型验证：真正实现视神经损伤的神经保护
构建小鼠急性视神经夹伤模型，模拟临床急性视神经损伤、退行性病变场景，通过活体OCT成像+组织学检测神经节细胞复合体（GCC）厚度，双重验证治疗效果。
- 空白对照组：损伤2周后，神经节细胞复合体（GCC）厚度下降20%，RGC大量死亡、视神经轴突严重退变（图7A、B）。
- 双基因敲低治疗组：GCC厚度显著保留，RGC存活数量、视神经轴突存活率大幅提升（图7CF）
- 野生型直接递送AAVmSncgCas9的保护效果优LSLCas9工具小鼠的全长mSncg递送Cre的介导体系。
图7. AAV-mSncg-CRISPR/Cas9靶向敲除 Ddit3/Sarm1 改善视神经压碎损伤后RGC 胞体及轴突存活
案例1：活体单细胞动态钙成像，捕捉疾病早期功能损伤（PNAS，2022，Liang Li，Yang Hu）
该研究利用AAV2mSncgjGCaMP7s实现RGC特异性钙探针精准表达，结合cSLO成像平台，可在活体小鼠中同步记录数千个RGC的光诱发钙信号，实现数周时长的单细胞纵向追踪。传统研究仅能观察细胞结构与存活数量，而该技术可精准捕捉视神经挤压、青光眼模型中RGC死亡前的功能表型转换，填补了疾病早期功能学评价的技术空白，为视神经保护药物、基因治疗的效果评估提供了全新在体检测手段。
图8.纵向Ca²⁺成像群体分析，直观展示ONC、SOHU青光眼模型中RGC活性的动态变化特征
案例2：靶向NMNAT2基因治疗，成功挽救视觉功能（Molecular Therapy. 2022，Fang Fang，Yang Hu）
研究证实青光眼病理状态下，RGC内源保护性基因NMNAT2显著下调。团队利用AAV2-mSncg-NMNAT2 Δex6玻璃体腔注射方案，在RGC中特异性过表达长半衰期NMNAT2突变体。该靶向治疗可有效提升RGC胞内NAD⁺水平，显著抑制青光眼、视神经损伤诱导的神经退行性病变，成功挽救RGC与视神经轴突损伤，最终保护动物视觉功能。
图9. NMNAT2介导青光眼神经保护的核心机制原理图
案例3：AAV-mSncg-CaMK IIα-T286D，基因治疗挽救神经损伤导致的RGC退行性凋亡 （Cell, 2021, Xinzheng Guo, Bo Chen）
视网膜神经节细胞（RGC）发生胞体兴奋性损伤或视神经轴突损伤后。CaMKIIα‑ T286 位点磷酸化水平降低，致使 CaMKII‑CREB 信号通路受到抑制。过表达组成型激活突变体 CaMKIIα‑T286D 可逆转病理损伤，保护 RGC 胞体与长距离轴突投射，维持视网膜‑视皮层完整视觉通路功能。借助 AAV2‑mSncg 启动子介导 CaMKIIα‑T286D 过表达，可实现治疗基因的 RGC 特异性递送，在保留 CaMKII 通路神经保护作用的同时，规避非靶细胞异位表达带来的潜在安全风险。
图10. CaMKII 对视网膜神经节细胞的保护作用及其视力保存效应
案例4：AAV-mSncg-Anxa2，基因治疗促进视神经再生和青光眼的治疗（Neuron，2022， Liang Li， Yang Hu）
研究借助单细胞转录组技术区分了再生型 RGC 与存活但无再生能力的 RGC，筛选出 Anxa2、ILK、Mpp1 等一批青光眼神经修复候选基因。这类靶点可通过AAV2‑mSncg 启动子实现 RGC 特异性递送，在青光眼模型中保护 RGC 胞体、轴突并维持视功能，为 RGC 基因治疗提供新的候选治疗基因库。
图11.Anxa2 可显著促进ONC视神经再生
案例5. AAV-CS265（截短型mSncg）-Gsn，基因治疗促进长距离视神经再生和青光眼的治疗（Science translational medicine，2026， Liang Li， Yang Hu）
Gsn 是凝溶胶蛋白，可剪切聚合态肌动蛋白 F‑actin，介导肌动蛋白解聚，是再生型 RGC 中显著上调的关键再生基因。研究利用 AAV2‑mSncg 启动子实现 Gsn在 RGC 中的特异性过表达，可降低轴突内 F‑actin 水平，恢复线粒体双向轴突转运，进而促进 RGC 轴突再生，同时保护 RGC 胞体，在视神经挤压、高眼压青光眼模型中实现神经保护与轴突修复。
图12.RGC特异性的Gsn过表达改善了小鼠SOHU青光眼模型中线粒体运输缺陷、视觉功能及RGCs和ON的存活率。
布林凯斯可提供mSncg启动子各类定制服务，请联系小布：18971216876（微信同号）或者咨询所在区域的销售经理获取更多信息。
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