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我们来喽！这里小莱会不定期与大家一同分享学习分子生物领域相关内容，死细胞虽然已经没了活性，但它们仍然存在于样本中，如果不加以排除，就会对流式结果产生不小的干扰。
死细胞之所以会影响流式数据，主要源于两个特点：一是膜破了，但抗原还在；二是膜通透性改变，各种染料都能自由进入。
细胞死亡后，细胞膜的完整性虽然丧失了，但表面的抗原并不会立刻消失。它们仍然能够结合抗体，这就带来了一个问题：我们测到的阳性信号，到底来自真正阳性的细胞，还是死细胞上残留的抗原？
比假阳性更麻烦的是第二个问题。膜破损后，死细胞内部暴露出来，各种荧光染料可以自由进入，非特异性地结合到细胞内各种分子上。这导致死细胞的荧光背景异常升高，而且没有特异性——它可能在所有通道里都发出信号，在散点图上常常表现为沿对角线分布的斜线信号。
这种非特异性结合会带来几个后果：假阳性率升高、细胞分群模糊、弱阳性群体被淹没在高背景里。一个很直观的例子是：外周血样本如果不排除死细胞，CD4和CD8的散点图上会出现一团异常的“双阳性”细胞群，而实际上正常情况下双阳性细胞表达极少。排除死细胞后，正常的互斥分布就恢复了，数据才真正可信。
排除死细胞主要有两种方式，一种是利用光散射特性，另一种是利用死活染料。
这是最简单快捷的方法。活细胞、死细胞和细胞碎片在光散射特性上有差异。前向角散射（FSC）大致反映细胞大小，侧向角散射（SSC）反映细胞内部颗粒度。死细胞通常会皱缩（FSC变小）、内部结构紊乱（SSC变大），因此在FSC/SSC图上，它们往往出现在活细胞群的左上方或左外侧。
这种方法操作简单，不需要额外染色，在圈门时就可以区分大部分死细胞。但它的局限在于，只能区分形态上明显异常的细胞。如果细胞刚死，形态变化还不明显，光靠FSC/SSC就不够用了。所以更多实验还需要用死活染料进一步确认。
使用死活染料是更精确的方法，原理都基于细胞膜的完整性。常见的有两类：
核酸染料：比如PI、7-AAD、DAPI。这类染料不能透过活细胞膜，只能进入死细胞结合核酸发出荧光。优点是方便，染色后直接上机即可。但缺点也很明显——不能洗，也不能固定，因为固定需要对所有细胞破膜，活细胞也会被染上。
胺活性染料：这类染料能与蛋白质上的伯氨基共价结合。活细胞只染上表面蛋白，荧光较弱；死细胞因为膜破损，染料进入内部结合大量胞内蛋白，荧光信号很强。最大的优点是染色后可以固定、可以破膜，很适合用于胞内染色实验。
从样本状态来看：如果是新鲜外周血、脾脏等处理得当的样本，死细胞比例较低，单靠FSC/SSC通常够用。但如果是肿瘤组织、难制备的组织、或者冻存复苏后的细胞，死细胞和碎片会很多，这时候必须用死活染料精确排除。
从实验需求来看：多色流式实验、弱表达抗原检测、胞内染色实验，都强烈建议做死活染色。道理很简单——颜色越多，背景越复杂；抗原越弱，越容易被死细胞的非特异性信号淹没。
反过来，如果只是常规检测新鲜外周血的CD3/CD4/CD8等强表达指标，FSC/SSC圈门基本够用。但前提是样本状态确实好，死细胞少，实验精度要求不高。
排除死细胞不是一个“要不要做”的问题，而是一个“做到什么程度”的问题。根据样本质量和实验精度要求，选择合适的排除方法。
对于常规样本和简单实验，FSC/SSC排除就够用了。对于复杂样本、多色实验或需要精确分析的情况，建议加上死活染料。如果实验涉及胞内染色，直接选择胺活性染料。无论哪种方法，都建议在分析时同时圈出活细胞门，这样才能确保最终数据反映的是真实细胞群体的状态。
排除死细胞是流式实验中一个容易被低估但非常重要的步骤。它不会直接帮你回答“细胞表达了什么”，但它能确保你回答这个问题时，数据是干净、可靠的
根据样本状态和实验需求，选择合适的排除方法，让流式结果经得起推敲。
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