客户文章｜Cell｜上交大王宏林团队解析神经-皮肤轴调控皮肤胶原稳态与衰老机制

    衰老真皮中成纤维细胞衰老（p16升高、SA-β-gal阳性）、I型胶原大量流失，是皱纹、皮肤松弛核心诱因；外周神经可分泌神经递质调控皮肤免疫，但神经如何直接调控皮肤衰老完全未知。皮肤神经是否参与胶原稳态？何种神经元、分子通路介导该过程？能否通过靶向通路干预皮肤老化？

    2026年7月17日，上海交通大学医学院附属第一人民医院王宏林团队，在 Cell 在线发表研究论文“Skin-innervating glutamatergic neurons modulate aging”，整合人类临床样本、多基因条件敲除小鼠、体外神经元-成纤维细胞共培养、电生理、蛋白质组、单细胞多组学、3D全组织荧光成像多维度交叉验证，发现皮肤谷氨酸能感觉神经元通过Nefh信号轴调控真皮成纤维细胞衰老与胶原蛋白稳态，首次建立皮肤神经-成纤维细胞抗衰调控通路。

    上海交通大学医学院附属第一人民医院王宏林教授为论文通讯作者，博士后王之凯为论文第一作者。本研究得到上海交通大学医学院附属仁济医院整形外科陈蕊主任、上海交通大学医学院附属第一人民医院麻醉科黄丽娜主任及其团队成员李珍、上海市高血压研究所李群教授及其团队成员方子龙、上海交通大学医学院附属第一人民医院实验动物中心杨玉琴主任、中科院分子卓越研究中心周斌教授、 以及上海交通大学医学院附属第一人民医院公共技术平台的帮助。

    为探究皮肤衰老相关的皮肤支配神经元特征，研究分析老年人类皮肤批量转录组数据（GSE85358），证实神经丝重链基因NEFH是老年皮肤下调最显著的基因之一（图1A、1B）。人、小鼠衰老皮肤中，Nefh蛋白表达均显著降低（图1C）。本研究纳入17–82岁共148名受试者、4个年龄分组，通过皮肤样本免疫荧光染色分析（图1D）。结果表明：皮肤NEFH表达与年龄负相关，与I型胶原蛋白含量正相关（图1E、1F）。D-半乳糖诱导的小鼠皮肤衰老模型中，同样观测到Nefh表达与真皮胶原密度同步下降。综上，衰老皮肤存在NEFH表达降低，并伴随胶原蛋白流失。

    NEFH是神经元损伤、肌萎缩侧索硬化症（ALS）的易感生物标志物，特异性标记含神经丝的感觉神经元。人皮肤、骨髓单细胞转录组测序（RNA-seq）几乎检测不到NEFH（图1G）。皮肤外科去神经、白喉毒素（DT）、树脂毒素（RTX）处理后，皮肤Nefh表达显著下调，证实Nefh仅特异性表达于皮肤支配神经元。小鼠背根神经节（DRG）单细胞核测序显示，DRG神经元可检测到Nefh，且谷氨酸能神经元标志物Vglut2广泛表达于Nefh⁺ DRG神经元（图1H、1I）。多数皮肤支配神经元共表达Vglut2与Nefh（图1J），且Nefh⁺神经元中Vglut2表达显著高于其他谷氨酸转运蛋白（图1K）。利用Vglut2^Cre-tdTomato示踪小鼠，可在小鼠皮肤与DRG中观察到Nefh与Vglut2共定位（图1L-1N）。向8周龄小鼠皮内注射携带EGFP的2型逆行腺相关病毒（AAV2-retro-EGFP）标记皮肤神经元，进一步验证二者共表达特征（图1O）。综上，Nefh主要表达于Vglut2⁺皮肤支配神经元。

图1. 与衰老相关的Nefh主要表达于Vglut2⁺皮肤神经支配神经元中

    研究构建Nefh^fl/fl; Vglut2^Cre敲除小鼠特异性敲除Nefh后，小鼠皮肤胶原密度、I型胶原及Vglut2表达显著下降（图2A-2F）。利用两组小鼠DRG神经元培养液处理人皮肤成纤维细胞，衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色证实，Nefh缺失会显著促进成纤维细胞衰老（图2G-2I）。为探究Nefh对DRG神经元的作用，通过AAV2-retro-EGFP标记皮肤支配神经元，发现Nefh^fl/fl; Vglut2^Cre小鼠Nefh⁺皮肤神经元数量显著减少（图2J、2K）。电生理结果表明，Nefh敲除会抑制DRG神经元动作电位（AP）发放，降低神经元兴奋性（图2L、2M）。Nefh缺失不影响神经元活性、轴突完整性及全神经元标志物βIII-微管蛋白表达（图2N-2P），不会造成神经元凋亡。转录组分析显示，敲除小鼠DRG下调基因富集ALS通路（图2Q、2R），与ALS患者皮肤胶原流失的衰老表型一致。Nefh敲除可下调Vglut2表达，通过AAV9-CAG-DIO-EGFP标记DRG神经元Vglut2囊泡，发现Nefh缺失会减少Vglut2⁺囊泡数量、减慢囊泡转运速度，破坏神经递质释放功能（图2S-2U）。Nefh缺失对γ-氨基丁酸（GABA）、P物质、降钙素基因相关肽（CGRP）等神经递质影响各异，因此研究后续聚焦Vglut2依赖的多功能神经递质——谷氨酸，探究其调控机制。

图2. Vglut2⁺谷氨酸能神经元中Nefh缺失可加速皮肤衰老并降低神经元兴奋性

    对胶原1α2诱导型工具鼠Col1a^2CreER-tdTomato小鼠皮肤全组织成像发现，与Nefh阳性皮神经接触的Col1a2阳性成纤维细胞周围均存在谷氨酸信号（图3A）。老年小鼠皮肤、人体衰老皮肤与血浆、去神经小鼠皮肤的谷氨酸含量均显著下降（图3B-3F）。通过检测慢病毒敲低Nefh（Sh-Nefh）、Nefh^fl/fl;Vglut2^Cre敲除小鼠DRG神经元培养液，证实Nefh表达下调会显著抑制神经元的谷氨酸分泌（图3G、3H）。对NIH-3T3细胞、小鼠及人原代真皮成纤维细胞开展谷氨酸干预实验，结果显示谷氨酸可有效促进胶原合成、下调衰老标志物p16，且不影响细胞活性（图3I、3J）。衰老相关β-半乳糖苷酶染色进一步证实，谷氨酸可显著缓解人真皮成纤维细胞衰老（图3K、3L），具备抑衰老、促胶原的双重作用。对18月龄老年小鼠开展梯度谷氨酸皮内注射，100μM、500μM剂量可有效提升皮肤胶原含量、降低p16表达（图3M-3O）。500μM及以下谷氨酸不会改变皮肤CD45阳性免疫细胞比例、不影响角质细胞活力，无炎症副作用（图3P、3Q）。同时，18月龄小鼠口服梯度谷氨酸干预实验证实，口服补充谷氨酸同样可提升真皮胶原密度、下调p16，有效改善皮肤衰老表型（图3R、3S-3U）。

图3. 谷氨酸可抑制皮肤成纤维细胞衰老并促进胶原蛋白生成

    相较于18月龄Nefh^fl/fl小鼠，Nefh^fl/fl; Vglut2^Cre小鼠皮肤I型胶原表达显著降低（图4A），研究对两种基因型18月龄小鼠开展皮内谷氨酸干预实验（图4B）。神经元Nefh缺失会引发皮肤胶原流失、谷氨酸下调、p16升高，而皮内补充谷氨酸可有效恢复胶原与谷氨酸水平、抑制衰老标志物p16表达（图4C-4H）。小鼠皮肤成纤维细胞实验证实，Nefh敲除会加剧成纤维细胞衰老，外源性谷氨酸可有效逆转该表型（图4I-4K）。利用两种基因型小鼠DRG神经元培养液处理人皮肤成纤维细胞发现，Nefh缺陷神经元培养液会抑制I型胶原合成，补充谷氨酸可挽救胶原表达损伤（图4L、4M）。对12月龄小鼠开展100μM谷氨酸口服干预，结果与皮内给药一致：Nefh缺失诱导的皮肤胶原流失，可通过口服补充谷氨酸有效改善（图4N-4Q）。综上，谷氨酸是Nefh介导谷氨酸能神经调控皮肤衰老的核心必需分子。

图4. 谷氨酸是Nefh介导的皮肤衰老谷氨酸能神经调节所必需的物质

    通过Nefh抗体免疫沉淀-质谱联合分析及GeneMANIA数据库分析，筛选得到Nefh互作蛋白Cdk5（图5A）。已有研究表明Cdk5参与细胞衰老、谷氨酸重摄取紊乱等过程。免疫共沉淀与荧光共定位实验证实，Cdk5可结合Nefh与Vglut2，且三者在DRG神经元中共表达（图5B-5D）。对AAV-Cre处理的Nefh^fl/fl小鼠及Nefh^fl/fl; Vglut2^Cre小鼠检测发现，Nefh下调会同步抑制Cdk5、Vglut2表达（图5E-5I）。Cdk5过表达挽救实验显示，Nefh缺失导致的Cdk5、Vglut2下调及谷氨酸分泌减少，可通过过表达Cdk5有效恢复（图5J-5L），明确Nefh→Cdk5→Vglut2级联调控通路。采用Cdk5特异性抑制剂处理DRG神经元，可显著下调Cdk5、Vglut2表达并减少谷氨酸分泌（图5M-5O）。该抑制剂处理后的神经元培养液，可抑制人皮肤成纤维细胞COL1A1表达（图5P），证实Cdk5是调控谷氨酸释放与胶原合成的关键分子。皮肤衰老伴随胶原流失，皮肤纤维化则存在胶原异常堆积。基于Cdk5对胶原合成的调控作用，本研究利用博莱霉素皮肤纤维化模型验证其功能（图5Q），结果显示Cdk5抑制剂可缓解胶原异常沉积、改善皮肤纤维化（图5R-5U）。同时，敲除谷氨酸能神经元Nefh亦可减轻纤维化损伤（图5V-5X）。综上，Nefh-Cdk5信号轴精准调控谷氨酸释放与皮肤胶原稳态，可作为皮肤纤维化潜在干预靶点。

图5. Nefh-Cdk5轴调控谷氨酸释放与胶原蛋白稳态

    谷氨酸受体与转运蛋白是谷氨酸发挥生理功能的关键分子，结合小鼠细胞图谱及皮肤转录组数据，筛选出高表达于皮肤、参与细胞活化的谷氨酸转运蛋白Slc1a3（图6A、6B）。利用Pdgfra^DreER-tdTomato小鼠标记成纤维细胞，免疫荧光验证Slc1a3主要表达于皮肤成纤维细胞（图6C、6D）。小鼠及人类衰老皮肤中Slc1a3表达显著下调且与年龄负相关（图6E-6J），提示衰老引发的Slc1a3缺失会破坏成纤维细胞谷氨酸信号稳态。人皮肤样本显示，NEFH阳性皮神经旁的PDGFRA阳性成纤维细胞高表达Slc1a3（图6K）。本研究构建成纤维细胞特异性敲除Slc1a3的Slc1a3^fl/fl; Col1a2^CreER小鼠模型（图6L-6O），10周龄敲除小鼠皮肤p16表达升高、胶原含量下降（图6P-6S），证实成纤维细胞Slc1a3缺失可直接诱导皮肤衰老。

图6. 皮肤成纤维细胞中Slc1a3基因缺失会加速皮肤衰老

    为探究Slc1a3的介导作用，本研究对10月龄Slc1a3^fl/fl对照小鼠与Slc1a3^fl/fl; Col1a2^CreER成纤维细胞特异性敲除小鼠进行谷氨酸干预（图7A）。结果显示，谷氨酸可改善对照组小鼠皮肤胶原合成与细胞衰老，但在Slc1a3敲除小鼠中完全失效（图7B-7G）。体外实验通过慢病毒敲低人皮肤成纤维细胞Slc1a3（图7H），正常细胞中谷氨酸可有效促胶原、抑衰老，而Slc1a3下调后该保护效应显著丧失（图7I-7L），证实Slc1a3是谷氨酸发挥调控作用的必要介质。148例人体皮肤样本分析证实，Slc1a3表达与I型胶原水平呈正相关（图7M），且NEFH⁺VGLUT2⁺皮神经旁的PDGFRA⁺成纤维细胞高表达Slc1a3（图7N）。综上，Slc1a3参与Nefh介导的神经-成纤维细胞抗衰老调控，为皮肤衰老干预提供了转化靶点。

图7. Slc1a3介导谷氨酸对皮肤成纤维细胞的促胶原生成及抗衰老作用

    本文首次证实皮肤谷氨酸能感觉神经元是皮肤衰老关键调控单元，建“外周神经→神经递质谷氨酸→成纤维细胞胶原稳态”全新衰老调控轴；揭示Nefh不只是神经元结构蛋白，更是调控神经递质释放的功能性衰老分子；提出谷氨酸（局部/口服）作为安全、易获取的抗皮肤衰老候选物质；为皱纹、光老化、硬皮病/瘢痕纤维化提供双重靶向治疗思路。