论文标题：De novo Design of Macrocyclic Molecular Glues
作者团队：Andrä Brunner、Krzysztof Wierbilowicz、Diandra Daumiller、Daniel Bexell、Kasper Karlsson、Olle Sangfelt、Patrick Bryant（Karolinska Institutet、Science for Life Laboratory、Stockholm University、Lund University）
文章链接：https://doi.org/10.64898/2026.08.21.746227
诱导邻近（induced proximity）药物的核心想法，是让原本不会相遇的蛋白靠到一起，从而改变细胞中的功能输出。PROTAC通常用双功能分子分别抓住靶蛋白和E3连接酶；分子胶（molecular glue）则更紧凑，却也更难按图索骥。许多已知分子胶来自偶然发现，后续工作往往是在既有化学骨架上优化。
难点不只在“找到两个结合位点”。三元复合物形成时，蛋白表面可能重排；一个能让E3连接酶靠近靶标的分子，也未必能把靶蛋白的赖氨酸摆到适合泛素转移的位置。因此，邻近、泛素化和降解是连续但不等价的三步。
这篇尚未同行评议的 bioRxiv 预印本提出 EvoBind-multimer（EBM）：只输入两条蛋白序列，直接生成同时接触二者的短宏环肽。作者以 VHL E3 连接酶为招募端，分别选择 KRAS 和 BRD4 为靶标，得到 6–10 个氨基酸组成的候选分子胶，并在活细胞、机制干预和患者来源神经母细胞瘤肿瘤球中逐层验证。
这项工作的价值不只是“又设计出几条肽”。它把一个通常依赖既有配体、已知结构和经验筛选的问题，改写成了从序列出发搜索三元界面的问题；同时，患者来源模型给出了一个很重要的反例：同一条分子胶在一种细胞背景中降解 BRD4，在另一种背景中却让 BRD4 积累。
一、从两条蛋白序列出发，搜索第三条“桥”
EBM 的输入是两个待连接蛋白的氨基酸序列。作者分别为两条蛋白生成多序列比对（multiple sequence alignment, MSA），构造配对和块对角化表示，再把两条蛋白与一条待优化的环肽作为三个物理实体送入改造后的单链 AlphaFold2。模型并不是把两个独立配体拼起来，而是在完整三元复合物里同时搜索蛋白A–肽、蛋白B–肽以及三者整体几何。
环肽从随机序列开始，并通过“循环偏移”表示头尾相连。每轮预测后，算法综合环肽 pLDDT 与环肽到两种蛋白的原子距离进行打分；若结构指标改善，就接受新序列并在单个位点继续突变。每条轨迹运行 1000 次迭代，让短肽逐步收敛到更稳定、更高置信度的三元复合物。
图 1｜EvoBind-multimer从两条蛋白序列生成宏环肽桥
输入两种目标蛋白的序列及其 MSA；随机初始化的环肽经改造的单链 AlphaFold2 预测、评分和单点突变反复优化，最后形成环肽同时接触两种蛋白的三元复合物。原图没有分面编号。
为了提高进入细胞的可能性，作者把设计空间限制在 4–10 个残基。每个长度采用 5 个不同初始化，每个靶标组合共生成 35,000 条候选环肽。一次迭代在单张 40 GB NVIDIA A100 上约需 30–40 秒，一条 1000 轮轨迹约需 8–11 小时；并行运行时，一个靶标组合可在一夜内完成候选生成。
这里也有一个有意思的模型选择。作者尝试用 AlphaFold3 和 Boltz-2 处理这些三元复合物，但认为它们更倾向复现 PDB 中常见的既有结合口袋，无法稳定恢复 EBM 探索出的新界面。作者据此选择改造一个没有显式用蛋白复合物训练的单链 AlphaFold2，把较弱的既有界面先验当作探索新界面的潜在优势。
二、把VHL接到KRAS和BRD4上
作者选择 VHL 作为 E3 连接酶受体，并分别设计连接 KRAS 或 BRD4 的宏环肽。理论路径是：环肽促成 VHL–靶蛋白三元复合物，Cullin-RING 连接酶把泛素转移到靶蛋白，随后由蛋白酶体处理靶标。
从每个体系的候选中，团队各合成两条排名靠前的环肽：VHL–KRAS 体系为 K587、K743，均为 10 肽；VHL–BRD4 体系为 B195（6肽）和 B938（10肽）。四条候选的环肽 pLDDT 均约为 90 或更高。由于这还是概念验证，研究通过脂质介导方式把肽送入细胞，绕开了天然细胞通透性这一尚未解决的药代问题。
图 2（A-F）｜宏环分子胶的设计、降解机制与活细胞验证
Figure 2A：以 VHL 与 KRAS/BRD4 的序列为输入，EBM 迭代产生桥接二者的环肽三元复合物。
Figure 2B：理论降解链条包括泛素装载、三元复合物形成、泛素转移、蛋白酶体识别及靶蛋白清除。
Figure 2C：K587 与 K743 的结构预测显示环肽位于 VHL–KRAS 界面。
Figure 2D：KRAS NanoBRET 中，两条设计肽在 MG-132 条件下出现更强的复合物累积信号；数据为 3 个生物学重复的均值±SEM。
Figure 2E：B195 与 B938 的预测结构把环肽放置在 VHL–BRD4 界面。
Figure 2F：BRD4 NanoBRET 中，B195 与 B938 在蛋白酶体抑制后均显著增强邻近信号；数据为 3 个生物学重复的均值±SEM。
表 1｜入选的VHL-KRAS与VHL-BRD4宏环肽设计
K587、K743、B195、B938 分别代表两类靶标体系的实验候选；表中给出序列、长度、两侧界面距离、环肽 pLDDT 与最终设计损失。
研究用活细胞 NanoBRET 检测 VHL 与靶蛋白是否被拉近。由于高活性降解剂会迅速消耗三元复合物，作者同时设置蛋白酶体抑制剂 MG-132：若抑制降解后 BRET 信号积累，说明体系中确实不断形成可被处理的复合物。
结果显示，在 MG-132 条件下，K587、K743 的 BRET 比率相对 MG-132 单独处理分别增加 37% 和 32.4%；B195、B938 分别增加 19.5% 和 23.3%。相应 p 值为 0.025、0.046、0.013 和 0.0003，趋势与 KRAS 阳性对照 LC-2、BRD4 阳性对照 MZ1 一致。这组实验支持细胞内靶标结合和三元复合物形成，但单靠 NanoBRET 仍不能证明已经发生降解。
表 2｜MG-132条件下的活细胞NanoBRET变化
细胞以 10 μM 设计肽处理 3 小时；MG-132 预处理后，四条设计肽与两个 PROTAC 阳性对照均出现显著的三元复合物累积。
三、形成复合物之后，靶蛋白真的被降解了吗
E3 连接酶靠近靶标只是必要条件。要把“结合”推进到“降解”，三元复合物还必须让靶蛋白表面的赖氨酸以合适方向接近泛素转移装置。作者因此设置两类机制干预：用 siRNA 降低 VHL，测试效应是否依赖所招募的连接酶；用 MLN4924 抑制 NEDD8 激活，阻断 Cullin-RING 连接酶核心功能。
在 KRAS 体系中，1 μM K587 和 K743 处理 24 小时后，内源 KRAS 相对 DMSO 基线分别降至 0.5 和 0.3；K743 与 1 μM LC-2 的 0.3 相当。敲低 VHL 后，KRAS 分别回升到 0.6 和 0.7，说明该效应明确依赖 VHL。不过，MLN4924 在本实验时间窗内对 K743 没有产生清晰救援，因此对不同候选的 CRL 依赖强度仍需谨慎解读。
BRD4 体系的链条更完整。B195 和 B938 把 BRD4 降至 0.4 和 0.5，100 nM MZ1 为 0.6；下游 MYC 也同步下降。敲低 VHL 后，BRD4 分别积累到 1.7 和 2.9；MLN4924 处理后回升至 1.1 和 1.5。这个“靶蛋白下降—阻断通路后救回—下游信号随之恢复”的组合，比单一蛋白条带更有力地支持了 VHL/CRL 依赖的蛋白酶体降解机制。
图 3（A-B）｜VHL与Cullin-RING通路依赖的靶蛋白调控
Figure 3A：K587、K743 降低内源 KRAS；siVHL 可救回 KRAS，K743 在 MLN4924 条件下的救援不明显。条带为 3 次独立生物学重复的代表结果。
Figure 3B：B195、B938 降低 BRD4 与下游 MYC；siVHL 或 MLN4924 均可使 BRD4 回升，支持 VHL/CRL 依赖机制。
表 3｜设计宏环分子胶的机制验证汇总
表格把基线降解、VHL 敲低和 CRL 失活三种条件并列，用于区分一般性结合、VHL 依赖效应和完整蛋白酶体降解链条。
四、患者来源肿瘤球给出相反答案
为了把验证从常规细胞系推进到更接近组织环境的模型，作者在两个患者来源异种移植（patient-derived xenograft, PDX）神经母细胞瘤肿瘤球 LU-NB-2 与 LU-NB-3 中测试 B195 和 B938，处理浓度提高到 10 μM。
在 LU-NB-2 中，两条宏环肽都显著降低 BRD4，并压低下游 N-Myc。B195、B938 处理后的 N-Myc/β-actin 比值分别为 0.46 和 0.62，与 MZ1 的 0.54 接近；VHL 敲低或 MLN4924 可不同程度救回 BRD4。这说明设计肽在三维患者来源模型中仍能进入细胞并调用内源降解机器。
但在平行处理的 LU-NB-3 中，结果反了过来。尤其 B195 让 BRD4 明显积累，而不是被清除；敲低 VHL 后，这种稳定化效应又被取消。作者据此判断，环肽仍然促成了 VHL–BRD4 邻近，却没有把复合物推进到有效泛素化和蛋白酶体处理，表现为类似 LOCKTAC 的VHL依赖性空间稳定/隔离。
图 4（A-B）｜患者来源肿瘤球中的BRD4降解与稳定化
Figure 4A：在 PDX 来源神经母细胞瘤肿瘤球中，通过 siVHL 与 MLN4924 区分三元复合物形成、BRD4 降解/积累及 N-Myc 输出。
Figure 4B：LU-NB-2 中 B195、B938 促进 BRD4 降解并抑制 N-Myc；LU-NB-3 中同样处理却导致 BRD4 积累，显示患者模型依赖的功能分叉。
**这不是一个可忽略的失败样本，而是全文最重要的机制边界之一。**它说明生成模型若只优化“能否形成稳定三元复合物”，仍不足以预测最终细胞表型。下一代方法还需要显式考虑靶蛋白赖氨酸朝向、E2–泛素转移几何、亚细胞定位、复合物动力学以及不同细胞的降解机器状态。
五、设计空间、模型分歧与当前边界
EBM 在两个靶标体系上都偏好更长的环肽：随着长度增加，候选通常表现为更低的设计损失和更高的环肽 pLDDT。这符合物理直觉——要同时接触两个原本没有天然亲和力的蛋白表面，需要足够的界面面积。筛选时，作者先从每种长度的生成结果取前 10%，每个靶标得到 3500 条候选；再以环肽 pLDDT ≥85 筛至 VHL–KRAS 的 646 条和 VHL–BRD4 的 353 条，最后结合损失、结构冲突与人工检查选择四条实验序列。
图 5（A-B）｜环肽长度与设计损失、结构置信度的关系
Figure 5A：VHL–KRAS 的前 10% 候选中，较长环肽总体呈现更低损失和更高 pLDDT；每个长度 n=500，须线为 95% 置信区间。
Figure 5B：VHL–BRD4 出现相同趋势，提示稳定三元界面需要足够的环肽接触面积。
作者还用 AlphaFold-Multimer、AlphaFold3 和 Boltz-2 重新预测四个入选复合物。相对于 EBM 参考结构，多数模型给出的蛋白整体位置和环肽位置差异远大于 2 Å；K587 是少数 AlphaFold-Multimer 与 EBM 较一致且置信度较高的案例。对 BRD4 体系，不同模型的界面和环肽位置分歧尤其大。
图 6（A-D）｜不同结构模型对四个三元复合物的交叉预测
Figure 6A：以 EBM 为参考，比较 AF3、AlphaFold-Multimer 与 Boltz-2 对 VHL 和 KRAS/BRD4 蛋白骨架的 RMSD；红线为 2 Å。
Figure 6B：比较三种模型中环肽重原子相对 EBM 的空间 RMSD，多数结果显著超过 2 Å。
Figure 6C：三种模型对两种蛋白亚基的平均 pLDDT 多较高，说明高蛋白置信度并不代表三元界面一致。
Figure 6D：环肽自身 pLDDT 的差异更明显；只有少数模型–候选组合超过 90。
这组比较不能证明 EBM 的结构就是实验真值，因为研究没有给出这些三元复合物的高分辨率实验结构。它更准确地说明：**现有模型对新型三元界面的预测并不一致，置信度也不能替代结构测定。**活细胞和蛋白水平实验验证了功能，却没有逐原子验证设计姿态。
此外，论文仍有几项明确限制。第一，预印本尚未同行评议。第二，候选通过脂质介导进入细胞，天然通透性、稳定性、暴露量和体内药代尚未解决。第三，目前只验证 VHL–KRAS 与 VHL–BRD4 两个组合，不能据此推断任意蛋白对都能被连接。第四，实验候选数量很少，缺乏系统的序列消融、亲和力测量和动物体内疗效验证。
六、结语
这项工作把宏环分子胶设计向前推进了一步：输入两条蛋白序列，生成一条同时接触二者的短环肽，再用活细胞邻近、通路救援和患者来源三维模型验证其功能。K587、K743、B195 和 B938 的结果支持 EBM 能找到具有细胞内活性的三元界面，而不仅是计算上看起来合理的折叠。
更值得重视的是，LU-NB-2 与 LU-NB-3 把“设计邻近”和“设计功能”清楚地区分开来。一个分子可以稳定连接 VHL 与 BRD4，却因细胞背景不同而分别触发降解或稳定化。未来生成式分子胶设计真正要预测的，不只是三元复合物能否形成，而是这个复合物在具体细胞中会被怎样处理。
从这个角度看，EvoBind-multimer 更像一条起点：它让新的三元界面成为可计算搜索的问题；而通透性、结构真值、靶标普适性和细胞背景，则决定这种搜索能否最终变成可控的药物功能。