在肝脏病理研究中，常规单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）相较完整细胞测序（scRNA-seq）具备不可替代的独特优势：snRNA-seq 仅提取细胞核，可兼容冷冻存档肝组织，无解离诱导的基因表达干扰，能够无偏捕获病变肝细胞、肝星状细胞、库普弗细胞等全部关键细胞亚群，精准还原慢性损伤下肝脏微环境真实转录状态，现已成为代谢性肝病、酒精性肝炎、肝纤维化、肝细胞癌（HCC）机制挖掘的首选技术方案。
本次分享依托基迪奥生物开展 snRNA-seq 全流程测序与深度生信分析服务，广州医科大学在 IF=81.2 的国际顶级靶向治疗期刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》发表重磅原创成果，完整构建 “单细胞图谱 + 3D 类器官 + 基因敲除动物 + 临床队列” 四维闭环验证体系，首次系统阐明 HGF/MET/UbD 信号轴是串联 MDB 生成、肝星状细胞活化、肝纤维化恶化、肝癌不良预后的核心分子开关，为慢性纤维化肝病精准靶向治疗提供全新可干预靶点，也为国内科研团队展示了一套可复制、高产出的单细胞肝病标准化研究范式。
● 发表期刊：Signal transduction and targeted therapy（IF=81.2）
我国慢性肝病患者基数超 4 亿，10%-20% 患者会逐步进展为肝纤维化，而 80% 以上肝细胞癌起源于纤维化 / 肝硬化病变肝脏，临床至今无 FDA 获批特效抗纤维化药物，阐明 MDB 介导肝损伤、纤维化、癌变的分子机制是临床转化刚需。
MDB 是慢性肝损伤标志性病理包涵体，既往研究仅明确其与蛋白酶体功能缺陷相关，但肝脏多类实质、间质、免疫细胞如何协同调控 MDB 发生、同步推动胶原沉积与肿瘤前病变的完整通路完全缺失；活化肝星状细胞（aHSC）是纤维化胶原分泌核心细胞，MDB 病变微环境下肝细胞 - 库普弗细胞 - 肝星状细胞三方通讯网络始终缺乏单细胞分辨率系统解析，极大限制肝病新型诊断标志物、靶向药物靶点挖掘。本研究打通 MDB 形成→肝纤维化→肝癌进展完整分子链条，明确 HGF/MET/UbD 为核心致病轴，填补领域关键机制空白，直接为纤维化相关慢性肝病提供全新治疗靶点。
单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）测序样本采用 C3H 雄性小鼠肝脏，严格设置 4 组梯度造模，每组 4 只生物学重复，完整模拟 MDB 发生、消退、复发全病理周期：
● DDC 饲喂组持续 10 周含 0.1% DDC 日粮诱导稳定 MDB；
● DDC 撤药组饲喂 DDC10 周后换普通日粮饲养 1 个月，实现 MDB 自发消退；
● DDC 复喂组撤药 1 个月后再次饲喂 DDC7 天，复刻 MDB 快速复发病理特征。
DDC 诱导 MDB 模型伴随明显胆汁淤积损伤，病变肝脏存在剧烈全局细胞异质性重塑
研究团队先依托领域标准 DDC 造模方案完成多维度病理验证，通过 H&E、马松胶原染色、油红 O 脂滴染色、α-SMA 免疫组化四类经典病理染色同步评估四组小鼠肝脏病变，DDC 持续刺激的饲喂组、复喂组肝脏出现典型胆汁淤积棕色素沉积、肝细胞气球样变性、大范围脂肪蓄积、大量炎性细胞浸润与胶原纤维堆积，若叠加 CCl₄ 毒素处理，MDB 包涵体数量与胶原沉积程度会进一步加剧，分子定量检测同步证实纤维化标志性基因 Acta2、Vim，以及 I/III/IV 型胶原编码基因转录水平显著升高，从组织形态与分子层面双重证实该模型可同步复刻 MDB 蛋白包涵体生成与进展性肝纤维化双重病理特征。
为解析病变背后细胞层面的重塑规律，团队开展覆盖全部四组小鼠的 snRNA-seq 测序，基于肝脏经典特征标记基因划分出肝细胞、库普弗细胞、肝星状细胞、胆管细胞、内皮细胞等九大肝脏固有细胞类型，对比各组细胞丰度变化可以清晰看到，DDC 持续干预会显著提升库普弗细胞、肝星状细胞、胆管上皮细胞占比，同时大幅压缩正常成熟肝细胞的细胞比例，对照组与撤药消退组细胞组成则相对稳定，这种剧烈的细胞丰度波动直观证明 MDB 病变进程会驱动肝脏微环境全局细胞重编程，也为后续细分致病细胞亚群、挖掘细胞间关键通讯信号通路打下坚实单细胞图谱基础。
图1 Mallory-Denk 小体（MDB）发病机制与肝纤维化、细胞异质性密切相关。
两类 MDB 特异性肝细胞 MAHs 具备差异化分子特征，Hep4 高丰度提示肝细胞癌不良预后
研究将图谱内全部肝细胞单独提取进行二次重聚类，最终划分出 Hep0 至 Hep5 六个肝细胞功能亚型，对比四组造模样本的亚型丰度变化能够清晰发现，仅 Hep4 与 Hep5 两个亚群在 DDC 饲喂、复喂的病变肝脏中出现爆发式数量扩增，二者共同稳定高表达 MDB 经典标志物角蛋白 K8、角蛋白 K18、p62（Sqstm1）以及泛素 D（UbD），据此研究团队将这两类病变肝细胞统一命名为 MDB 相关肝细胞 MAHs。
进一步对两类 MAH 亚型开展通路富集、分化潜能、基因组拷贝数变异多层次解析，二者功能特征存在显著分化：Hep4 细胞高度富集肝细胞癌发生、细胞凋亡相关信号通路，CytoTRACE 分化潜能分析显示该亚群细胞幼稚化程度更高、恶变潜能更强，InferCNV 拷贝数变异检测发现 Hep4 存在 1 号、6 号染色体片段扩增，基因组不稳定性显著；Hep5 细胞则主要富集氧化磷酸化、线粒体代谢与神经退行性疾病相关通路，全线粒体编码基因整体表达大幅上调，对应组织内线粒体 DNA 总量同步升高，提示该亚型肝细胞以线粒体功能损伤为核心病变特征。
依托 TCGA-LIHC、LIRI 两大公共肝癌队列开展细胞丰度反卷积分析，生存曲线结果明确证实肝脏内 Hep4 细胞占比越高，肝癌患者总生存期越短，亚型特征基因 Slc7a11 在晚期肝癌中特异性高表达，临床肝癌组织免疫荧光染色也验证 Slc7a11 与 MDB 标志物 p62 共同定位在气球样病变肝细胞内，充分证明 MAH 亚型分子特征可作为肝癌分层、预后评估的新型生物标志物。
图2 MDB 相关肝细胞（MAHs）的产生及其分子特征。
活化肝星状细胞 aHSC 是 MDB 病变特异性致病亚群，MMP14 可作为纤维化与肝癌双重预后标志物
肝星状细胞是肝纤维化胶原沉积的核心效应细胞，为厘清其在 MDB 病变中的异质性变化，团队对图谱内肝星状细胞亚群单独重分群，最终区分出四类功能完全独立的肝星状细胞亚型：静息型 qHSC、活化促纤维化 aHSC、内皮相关 Mmp14-Bmp2⁺ 亚群、炎症相关 Mmp14-IL7r⁺ 亚群，在 DDC 持续刺激的两组病变样本中，促纤维化 aHSC 亚群与炎症相关 Mmp14-IL7r⁺ 亚群细胞比例出现显著上升，KEGG 通路环形富集、GSEA 基因集富集分析共同证明 aHSC 细胞特异性富集细胞外基质互作、PI3K-AKT、TGFβ、上皮间质转化 EMT 等经典促纤维化核心通路。
针对基质金属蛋白酶 Mmp 家族开展表达谱解析可见，aHSC 是 Mmp2、Mmp14 等胶原重塑关键基因的主要表达细胞，小鼠肝脏转录定量、蛋白免疫印迹均证实 DDC 处理会显著上调 MMP14 表达；研究进一步拓展至人临床配对肝癌与癌旁正常组织，肿瘤病灶内 MMP14、α-SMA 蛋白表达水平显著高于癌旁组织，基于 TCGA 肝癌队列的 Kaplan-Meier 生存分析明确 MMP14 高表达对应肝癌患者更短生存期，由此确立 MMP14 既是 MDB 相关肝纤维化的核心效应分子，同时也是肝细胞癌预后评估双重可靠生物标志物。
图3 单细胞分析鉴定 MDB 病变肝脏中异质性肝星状细胞（HSC）亚群。
配体受体互作锁定 HGF/MET 为病变核心通讯轴，原创 3D MDB 类器官证实肝细胞与肝星状细胞双向促损伤环路
依托单细胞配体 - 受体互作算法挖掘四组样本肝脏细胞间信号交流网络，互作热、气泡图直观展现 DDC 病变肝脏中肝细胞与库普弗细胞、肝星状细胞之间存在大量异常信号配对，其中 HGF-MET 配体受体组合在 MAHs（Hep4/Hep5）与库普弗细胞、活化肝星状细胞的互作组合中富集程度排名首位，GSVA 通路富集分析同步验证 MAHs 细胞内 PI3K/AKT、STAT3 两条下游信号通路显著激活，初步锁定 HGF/MET 是调控 MDB 包涵体生成的核心细胞通讯轴。
为突破传统 2D 细胞培养无法还原肝脏三维微环境的局限，研究全球首次构建可稳定传代、冻存复苏的小鼠 MDB 三维类器官（MDO）体外模型，该类器官能够稳定表达 K8、UbD、p62 全部 MDB 特征蛋白，完美复刻体内肝细胞气球样变性、蛋白聚集的病理表型；通过直接接触、间接分隔两套共培养体系将 MDB 类器官与 JS-1 肝星状细胞共孵育，细胞上清 ELISA 定量结果显示 MDB 类器官可分泌 TGFβ1 诱导肝星状细胞活化，活化后的肝星状细胞又反向大量分泌 HGF，进一步加剧肝细胞 MDB 病变，完整证实二者之间存在双向放大病理损伤的信号环路；同时体外 Raw264.7 巨噬细胞与病变 Hepa1-6 肝细胞共培养实验补充证明，MDB 阳性肝细胞可刺激巨噬细胞合成释放 HGF，完整完善库普弗细胞来源 HGF 的调控机制。
图4 MDB 发病过程中 HGF/MET 信号轴显著富集。
HGF/MET 通路激活 NF-κB、STAT3 双重通路，上调 UbD 形成炎症正反馈持续驱动 MDB 生成
研究依托 TNFα 联合 IFNγ 预处理的 Hepa1-6 体外肝细胞模型开展精细分子机制验证，外源性给予重组 HGF 刺激后，细胞内 MET、AKT、IκBα 蛋白磷酸化水平呈时间依赖性持续升高，NF-κB、STAT3 两条通路转录活性同步增强，生物信息预测结合荧光定量验证发现两条通路均可特异性结合 UbD 基因启动子区域促进其转录；分别使用 MET 特异性抑制剂 PF-02341066、PI3K 通路抑制剂 LY294002 干预后，整条通路磷酸化激活效应完全被阻断，UbD 表达显著下调，细胞内 MDB 样蛋白包涵体生成大幅减少，在 3D MDB 类器官体系中使用 MET 抑制剂处理，同样观察到类增殖受阻、体积缩小，K8、p-AKT、p-IκBα、STAT3、UbD 共定位荧光信号同步减弱，从 2D 单层细胞、3D 立体类器官双重层面完整验证 HGF/MET 依赖 NF-κB、STAT3 调控 UbD 表达的分子机制。
通路持续激活后肝细胞会大量释放促炎因子 TNFα，而 TNFα 能够反向促进 HGF 基因转录，由此形成持续放大肝脏炎症、加重 MDB 生成的自反馈环路；人 MDB 阳性肝癌临床组织蛋白检测结果显示，p-MET、p-AKT、p-IκBα 磷酸化蛋白在肿瘤组织中显著高于配对癌旁组织，免疫荧光共染也确认磷酸化通路蛋白与 MDB 标志物 p62 共同定位在气球样病变肝细胞内，完成临床样本层面机制佐证。
图5 HGF/MET 信号轴通过 NF-κB、STAT3 通路驱动 MDB 形成。
UbD 基因敲除显著抑制 HGF/MET 信号，体内阻断 MDB 形成与肝纤维化进展
为在动物体内明确 UbD 在整条调控轴中的因果核心作用，研究利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建 UbD 全基因敲除（UbD⁻/⁻）小鼠，同步设置单纯 DDC 造模、DDC 联合 CCl₄ 重度纤维化两套损伤模型，对比野生型与敲除小鼠检测结果可见，UbD 敲除小鼠肝脏内 UbD、K8、p62 全部 MDB 核心标志物转录、蛋白水平大幅下降，肝脏组织 HGF 分泌量、促炎因子 TNFα 含量同步降低，肝脏内 HGF/MET、NF-κB 通路磷酸化激活效应被显著抑制，仅 STAT3 总蛋白表达无明显改变。
针对纤维化相关指标系统检测可见，UbD 缺失能够显著抑制肝星状细胞活化进程，阻断上皮间质转化 EMT 发生，纤维化标志物 Mmp14、α-SMA、I/III/IV 型胶原，以及 EMT 标志物 Vim 表达全部明显下调，免疫荧光染色证实敲除小鼠肝脏内波形蛋白阳性活化肝星状细胞数量大幅减少；多通道病理切片染色直观呈现，UbD⁻/⁻小鼠肝脏内 MDB 包涵体、脂肪空泡、胶原纤维沉积、肌成纤维细胞浸润程度均远轻于野生型对照小鼠，在 DDC 联合 CCl₄重度纤维化复合模型中，UbD 敲除带来的病变缓解效果更加突出，直接证明 UbD 是 HGF/MET 通路介导 MDB 生成、肝纤维化进展不可或缺的下游核心效应分子。
图6 敲除 UbD 可抑制 MDB 形成与肝纤维化进展。
本研究选用 snRNA-seq 规避传统 scRNA-seq 肝细胞解离破碎、转录应激偏差的缺陷，全景解析 MDB 病变肝脏完整细胞图谱，创新性定义两类功能分化的 MAH 致病肝细胞、四类异质性肝星状细胞，填补 MDB 病理单细胞层面研究空白。
本研究搭建完整标准化科研流程：单细胞核转录组图谱构建→细胞亚群精细分群→配体受体互作筛选核心通讯通路→3D 类器官体外功能验证→基因编辑动物体内因果验证→公共临床队列转化验证，整套范式可直接复制应用于酒精肝、代谢性脂肪肝、胆汁淤积性肝病、病毒性肝炎等全部慢性肝脏疾病机制挖掘，通用性极强。
snRNA-seq 凭借兼容冻存病理样本、无解离偏差、完整捕获肝细胞的独特优势，将持续主导慢性肝病细胞异质性、微环境通讯、靶点挖掘类基础与转化研究，结合多组学联合测序、单细胞药物筛选，能够快速实现从基础机制到临床精准诊疗的落地转化。
广州基迪奥生物深耕单细胞测序领域，针对肝脏、肿瘤、神经、免疫等复杂组织拥有专属细胞核分离、单细胞悬液制备优化方案，完美解决肝脏大肝细胞、脂肪变性组织解离困难、细胞丢失等行业共性难题，可一站式提供 snRNA-seq、scRNA-seq、空间转录组、单细胞免疫组库全套测序服务。
如果您有项目需求，欢迎联系我们，基迪奥生物将为您提供定制化的项目解决方案。
*未经许可，不得以任何方式复制或抄袭本篇文章之部分或全部内容。版权所有，侵权必究。
SCIPainter