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同时观测细胞内多个蛋白质是生物学研究长期面临的挑战。传统荧光成像依赖不同颜色的染料标记，但随着观测目标增加，有限的荧光颜色成为瓶颈，且光谱重叠严重降低了图像质量与复杂生物过程的解析能力。
近年来，设计能特异性识别染料的小型蛋白标签成为新方向。然而，天然蛋白难以兼顾稳定折叠、小体积与高亲和力，基于天然模板的传统蛋白工程不仅耗时，更受限于天然结构本身。
2026 年 7 月 16 日，大卫·贝克（David Baker）团队在《Science》发表论文，提出NovoTag技术路线。该研究结合 AI 蛋白设计、结构预测与实验筛选，从零开始设计了能特异性结合不同荧光染料的新型蛋白标签，构建出一套适用于多目标荧光成像的蛋白—染料体系。
论文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.aeb0822
重新设计蛋白：从“修补”到“从头构建”
过往荧光标签多基于天然蛋白改造，通过定点突变或定向进化优化结合能力。但天然蛋白的结构并非为识别人工染料而生，优化空间有限。
本研究团队另辟蹊径，借鉴“伪环状结构”思路，直接设计全新蛋白。其核心在于让蛋白形成封闭环状口袋，将染料包裹其中，使蛋白空间结构从一开始就围绕目标荧光染料构建，而非在天然蛋白基础上修补。
图 1：结合 Janelia 荧光染料蛋白的设计与表征。
技术上，团队利用生成式深度学习模型 Cα RFdiffusion，直接围绕每种染料的三维结构生成蛋白质骨架，实现从起点即锁定染料位置与形状。随后使用 LigandMPNN 赋予序列，并通过 Rosetta 计算结合能、AlphaFold2 验证序列 - 结构一致性。经过数千个候选筛选及酵母表面展示、流式分选确认，最终获得高置信度设计。
针对人工合成的罗丹明衍生物（Janelia Fluor 染料），团队成功创造出三种小型结合蛋白：NovoTag494、NovoTag596和NovoTag657，分别特异性结合绿、橙、远红三种染料。尽管三种染料共享同一罗丹明核心骨架，仅边缘化学修饰存在细微差异，但 NovoTag 展现了如精密模具般的识别能力，精准区分取代基的微小差别。
图 2：利用 NovoTags 在活细胞和固定细胞中进行多重超分辨率荧光显微镜成像。
进入应用场景：计算与实验的完美闭环
蛋白设计的最大难点在于跨越计算预测与生物实验的鸿沟。计算模型中完美的结合口袋，常因折叠不稳定或细胞环境复杂而失效。
团队通过实验筛选，确认了部分从头设计的蛋白不仅能高度特异性识别染料，还具备小尺寸和高稳定性。通过调整结合口袋结构，不同 NovoTag 可作为独立的“分子接口”，选择性结合对应染料并避免交叉干扰。
图 3：基于荧光寿命的 NovoTags 多重成像显微镜技术。
AlphaFold 3 预测进一步证实，三种 NovoTag 与各自靶标染料形成的复合物置信度极高。实验数据显示，它们对靶标染料的亲和力达到纳摩尔级别（Kd 分别为 19.1 nM、1.5 nM 和 2.0 nM），而对其他两种染料的特异性超过 1000 倍。
新一代标记方式：从“模仿自然”到“超越自然”
NovoTag 的出现标志着蛋白质设计迈上新台阶：自然界从未进化出结合人工染料的蛋白，但计算工具让我们能为任意小分子量身定制结合器。
尽管面临提高设计成功率、扩大染料识别范围及适应更复杂生物环境等挑战，但其潜力巨大。研究团队估算，若结合先进的光谱解混技术和寿命区分，未来有望实现 30 种以上探针的同时分辨，为多维生物成像开辟新路径。