今天分享一项面向功能定向多肽设计的研究——TD3B(Transition-Directed Discrete Diffusion for Allosteric Binder Generation)。与多数结构生成方法不同，这项工作不再只追求“候选分子是否能够结合靶点”，而是进一步提出：能否让生成的binder按照用户指定的方向，推动蛋白进入激活态或抑制激活态？
作者将这一问题表述为蛋白功能状态转移方向的控制问题，并在PepTune预训练的掩码离散扩散模型基础上，引入Direction Oracle、亲和力软门控、轨迹感知树搜索以及加权微调，使模型能够分别生成agonist-like和antagonist-like binder。这项工作的核心价值可以概括为一句话：把binder设计从“结合得好”推进到“结合后把蛋白状态推向指定方向”。
1 为什么“高亲和力”并不等于“功能正确”
蛋白变构调控并不只是稳定某一个静态构象，更重要的是改变蛋白在不同功能状态之间的转移倾向。对于GPCR等信号蛋白，配体的药理作用通常不仅取决于是否结合，还取决于结合后是否促进受体激活、抑制激活，或改变后续信号通路。
现有的RFdiffusion、BindCraft、BoltzGen和RareFoldGPCR等方法，主要仍属于结构中心设计：给定一个靶点构象或结合界面，生成能够稳定结合的蛋白或多肽。它们擅长回答“能不能结合”，却难以直接回答“结合以后产生什么方向的功能效应”。
这带来三个关键问题：
静态结构难以表示方向性。inactive→active与active→inactive是两种不同的状态转移方向，仅靠一个终态结构很难完整刻画。
亲和力不能替代药理功能。强结合分子既可能是激动剂，也可能是拮抗剂；提高affinity并不会自动得到正确的功能方向。
真实转移速率通常不可观测。对大多数binder，无法直接获得其对不同状态转移速率的影响，只能利用full agonist、partial agonist、antagonist等粗粒度标签进行监督。
因此，TD3B的目标不是直接重建真实动力学轨迹，而是从已有功能标签中学习一个可用于生成引导的方向性代理信号。
2 TD3B的整体框架：生成—打分—回训
图1展示了TD3B的完整闭环，可以分为三个部分。
模型接收靶蛋白序列(x)和用户指定的方向(d*)：
-
(d*=+1)：生成agonist-like binder，即倾向于促进激活； -
(d*=-1)：生成antagonist-like binder，即倾向于抑制激活。
作者将靶蛋白简化为inactive和active两个宏观状态，并假设binder会对两者之间的转移产生方向性扰动。需要强调的是，这里的“状态转移”主要是一种建模抽象，论文并没有直接观测或模拟完整的转移速率矩阵。
TD3B以PepTune的预训练掩码离散扩散模型为生成骨架。模型从一串mask token出发，逐步恢复为完整的binder表示。
生成时使用trajectory-aware tree search：
每个节点表示当前的部分序列；
每条边对应一次去掩码选择；
从根节点到叶节点形成一条完整生成轨迹；
多条轨迹并行探索，以增加发现高潜力候选的概率。
TD3B并不是重新设计一种全新的扩散架构，而是在已有肽生成模型上加入目标引导和摊销式微调。靶点信息也不是直接改变生成骨架，而是主要通过后续reward对候选采样和模型更新产生影响。
每个候选binder都会经过两个模型：
Affinity predictor (gψ(y,x))：判断候选与靶点是否具有基本结合可能性；
Direction Oracle (fϕ(y,x))：判断候选更偏向agonist还是antagonist。
随后，候选按reward加权进入replay buffer，高reward样本在后续训练中获得更大的更新权重。这里不是固定阈值式硬筛选，而是一个连续的软加权过程。
3 Gated Reward：先保证能结合，再判断方向是否一致
TD3B的核心奖励函数为：
Gated Reward=结合可能性×方向一致性
其中：
gψ(y,x)是预训练亲和力模型输出的归一化分数；
fϕ(y,x)是Direction Oracle的方向分数；
(d*)是用户指定的目标方向；
温度参数控制方向分数对reward的敏感程度。
当用户希望生成激动剂时，只有Direction Oracle方向分数>0的候选才能获得较高方向奖励；当用户希望生成拮抗剂时，只有Direction Oracle方向分数<0的候选更有优势。
因此会出现三种典型情况：
方向正确但几乎不结合：亲和力门控接近0，最终reward仍然很低；
结合较好但方向错误：方向项受到抑制，最终reward不高；
既可能结合又符合目标方向：获得高reward，并在回训中占据更大权重。
值得注意的是，论文把affinity定义为soft gate，而不是单纯追求“越高越好”。概念上，这是为了强调：结合是方向性调控成立的前提，但不应被视为药理功能本身。
4 模型如何把高reward候选“学回去”？
TD3B不直接对不可微的reward做端到端反向传播，而是先生成并评价一批候选，再通过加权监督学习更新扩散模型。完整目标包括三部分：
每个buffer样本都会根据reward转换为权重(w(y))。高reward候选权重大，模型更积极地学习如何复原这些序列；低reward候选权重小，对参数更新影响有限。
换句话说，reward负责回答“哪些序列更好”，WDCE负责让模型“以后更容易生成这些序列”。
作者希望agonist-like和antagonist-like binder在隐空间中形成可区分的表示：
同方向样本彼此靠近；
不同方向样本彼此远离。
这一项用于避免模型只学会“生成binder”，却无法在表征层面区分激动与拮抗方向。
KL regularization约束微调后的模型不要偏离预训练分布过远，以降低模式坍塌和不合理序列的风险。消融结果表明，去掉该项后虽然部分方向指标可能上升，但另一方向容易明显退化，说明无约束微调会破坏原有生成先验。
5 Direction Oracle：把药理标签压缩成方向监督
Direction Oracle是整个框架的关键，因为后续tree search、reward和最终方向评价都依赖它。
作者从IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology整理功能数据，将条目标记为：
full agonist；
partial agonist；
antagonist；
negative。
经过MMseqs2去冗余后，初始数据包括1,446个训练样本和336个held-out test样本。为了避免模型仅通过靶点身份猜测方向，作者进一步去除长度不在16–128范围内的binder，并只保留同时具有agonist和antagonist信息的双方向靶点，最终得到130/34/88个训练、验证和测试target–binder pairs。
标签被压缩为二元方向：
full agonist与partial agonist→(+1)；
antagonis →(-1)；
negative的置信权重设为0，不参与方向监督；
partial agonist使用低于1的置信权重，以体现标签的不确定性。
靶蛋白序列由ESM2编码，binder由SPE tokenizer表示。两者分别得到pooled embedding 后，通过可学习gating mechanism融合，再由MLP输出方向分数(fϕ(y,x))。
在测试集上，Direction Oracle的Accuracy、Precision、Recall和F1分别为0.93、0.90、0.91和0.90。这说明分类器在当前数据划分上具有较好的方向判别能力。
不过，这一结果仍需谨慎解读：可用于双方向训练的数据规模较小，而且部分antagonist数据由生成方法补充。Direction Oracle的性能是否能泛化到新靶点、全新序列以及真实药理实验，仍需要更严格的外部验证。
6 结果：TD3B能否真正控制agonist与antagonist方向？
图2A显示，TD3B生成候选的预测affinity分布相较RFDiffusion整体右移。图2B则显示，未经过方向微调的预训练模型天然更偏向agonist-like区域，而TD3B能够生成分布更分离的两个方向。
但图2A存在明显的评价闭环：亲和力预测器本身参与了训练reward，随后又用相同或高度相关的predictor证明生成样本affinity更高。因此，这一结果更适合解释为：TD3B成功学习了affinity gate所偏好的序列区域，并在方向优化过程中没有牺牲该代理指标。
它并不能替代独立的结构能量评估、实验亲和力检测或外部盲测。
表2比较了预训练模型、Classifier Guidance、SMC、TDS、PepTune、TR2-D2以及TD3B的不同版本。
完整TD3B的gated reward为5.2，是所有方法中最高的；在目标为antagonist时，direction accuracy达到1.00，但agonist方向只有0.66。这说明TD3B确实增强了方向控制能力，但两个方向的性能并不对称。
消融实验还显示：
去掉(Lctr)后，模型难以稳定分离两个方向；
去掉(Lreg)后，agonist accuracy上升到0.95，但antagonist accuracy降至0.30，说明无约束微调导致方向空间失衡。
作者将success rate定义为同时满足：
预测affinity高于长度匹配的WT reference；
Direction Oracle判断方向正确。
在该定义下，forward transition的成功率为61%，reverse transition为100%。这进一步说明模型在两个方向上的可控性并不均衡，同时也应注意，这个success rate仍由训练体系内的两个代理模型共同决定，并非实验意义上的真实成功率。
7 GLP-1R案例：用关键残基接触解释功能差异
作者使用AlphaFold3预测TD3B候选与GLP-1R的复合物结构，并比较agonist与antagonist的结合位点。
TD3B设计的agonist被预测可接触Tyr148、Tyr152、Arg190、Lys197、Tyr205、Gln234、Trp297、Thr298、Arg299和Asn300等激活相关残基，其中Arg299和Asn300被认为与完整激动活性密切相关。相对地，设计的antagonist缺少与Arg299和Asn300的接触。
这一案例为方向预测提供了结构层面的可解释性：同一靶点上的两类候选可能通过选择性接触或避开激活关键残基产生不同功能倾向。
但这仍属于预测结构上的事后解释。AF3复合物、接触残基和Direction Oracle标签之间的一致性，并不能直接证明候选真实具有激动或拮抗活性。
8 这项工作的真正创新与主要局限
把功能方向作为生成目标。相比只优化结构或亲和力，TD3B首次系统地将agonist/antagonist方向信息嵌入离散扩散生成流程。
构建生成—评价—回训闭环。Tree search负责探索，gated reward负责排序，WDCE将高reward样本内化到生成模型中。
利用对比学习塑造方向表征。模型不仅在输出端被分类，还在隐空间中主动分离两种功能方向。
框架具有可扩展性。理论上，只要能构建可靠的功能oracle，就可以将这一思路迁移到偏向性信号、细胞通路选择性或其他方向性功能设计任务。
“状态转移”主要是标签层面的抽象。模型并未直接学习真实的动力学轨迹、转移速率或自由能面。
训练与评价高度依赖同一组代理模型。Affinity predictor和Direction Oracle同时参与优化与评价，存在代理指标自证风险。
方向数据规模较小。双方向target–binder数据只有百量级，且包含合成antagonist，容易限制跨靶点泛化。
缺少独立实验验证。目前没有SPR、细胞功能实验、突变验证或系统MD分析来证明候选的真实结合与药理方向。
方向控制仍明显不对称。Agonist与antagonist指标差异较大，说明数据偏差和预训练先验仍在影响最终生成分布。
9 小结与展望
TD3B的意义不在于它已经解决了真实的变构动力学设计，而在于它提出了一种值得关注的研究范式：不再把生成模型只当作“高亲和力序列制造器”，而是尝试让功能机制本身成为可优化的生成条件。
从方法上看，它把离散扩散、树搜索、外部奖励模型、对比学习和KL正则整合为一个方向引导微调框架。结果表明，模型可以在代理指标层面分别偏向agonist-like和antagonist-like序列，并在GLP-1R等案例中呈现不同的关键残基接触模式。
未来更关键的工作，是引入与模型训练相互独立的验证体系，例如：
-
使用外部结构模型或物理能量函数进行盲评； -
通过长时间尺度MD或Markov state model验证状态偏移； -
利用细胞信号实验直接测量agonism、antagonism与biased signaling； -
将实验数据持续回流，重新训练更可靠的功能oracle。
当“方向标签”能够被真实动力学和实验功能数据支撑时，这类方法才可能真正从功能方向预测走向功能方向设计。
原文链接
https://openreview.net/pdf?id=RNuC8Nj6rD
往期文章
Proc. Natl. Acad. Sci. | AI蛋白质结构预测模型对静电相互作用的刻画精度
【David Baker 子刊解读12】给 ProteinMPNN 装上原子视野