许多口服递送研究都会遇到同一个起点：

活性分子在体外具有明确功能，进入胃肠道以后却可能受到低 pH、消化酶、胆盐和离子环境的共同影响。

纳米载体被引入以后，研究问题随之变成：载体能否保护活性分子，使它经历胃肠过程后仍保持可用状态？

这个问题包含几个彼此衔接的实验层级。

• 颗粒尺寸没有明显变化，说明载体的胶体状态相对稳定；

• 样品中还能检测到 cargo，说明活性分子仍保留可测结构或化学信号；

• 处理后的样品仍能激活受体或推动细胞功能，才把证据推进到生物活性保留。

三层结果组合起来，才能描述载体保护作用发生在什么位置。

本 protocol 面向蛋白、多肽、核酸、酶和其他容易受到胃肠环境影响的活性物质，也适用于脂质体、聚合物纳米颗粒、细胞外囊泡、细菌外膜囊泡及其他口服纳米递送体系。实验流程分为快速压力筛选和胃—肠连续消化两种路线，研究者可以根据课题阶段选择。

“胃肠稳定性”可以指向不同的问题。

课题早期常见的目标，是判断载体在强酸条件下会不会快速聚集或解体；

进入系统评价阶段以后，研究者还需要考虑胃蛋白酶、胰酶、胆盐、离子强度和胃—肠环境转换。

实验条件需要与准备提出的结论保持一致，因此，正式开始前先选择模拟路线。

例如我们前两天分析过的文献案例采用第一条路线：OMV/FGF2 在 pH 1.2 的模拟胃液中于 37 ℃孵育，0、1、2 和 4 h 通过 NTA 观察粒径与颗粒浓度。这个设计适合回答“强酸暴露是否迅速破坏囊泡结构”。若研究目标进一步延伸到完整口服过程，可以在此基础上加入胃蛋白酶、胰酶、胆盐以及胃相向肠相的连续转换。（这里采用“模型—结论匹配”。单一低 pH 模型对应酸稳定性，含酶 SGF 对应胃相消化耐受，SGF→SIF 连续模型对应上消化道全过程。先限定模型能够代表的生理问题，后面的实验结论会更清楚。）

pH 1.2 常用于较强的酸压力或药典式筛选，pH 3.0 则对应 INFOGEST 2.0 的标准胃相条件。两种条件分别服务于极端耐受筛选和标准化生理模拟。研究中可以先后使用，也可以平行比较，并在方法部分说明所代表的给药场景。

标准化研究可以参考 INFOGEST 2.0 静态消化体系。该体系按照口腔、胃和小肠顺序设置电解质、消化酶、胆盐、pH、稀释比例和消化时间，便于不同实验室之间比较结果。它属于静态模型，各阶段采用固定条件，适合评价消化终点和阶段性变化；胃排空、持续分泌和动态 pH 变化需要半动态或动态模型补充。

INFOGEST 2.0 最初用于食物消化研究。迁移到药物或纳米制剂时，需要根据剂型说明是否保留口腔相、是否加入食物基质，以及样品与消化液比例如何确定，同时保持各组的介质和稀释过程一致。（快速筛选和标准化连续消化承担不同任务。前者适合比较大量配方，条件简单、通量较高；后者提供更接近生理过程的环境组合。常见研究路径是先用压力筛选淘汰明显不稳定的配方，再让候选配方进入连续消化。）

一套口服载体经胃肠处理后可能出现多种状态。颗粒可以保持完整，而 cargo 的构象已经改变；颗粒也可能发生部分解体，同时释放出的 cargo 仍保留活性。实验设计需要同时观察载体和 cargo。

这一层观察：

常用方法包括 NTA、DLS、zeta potential、TEM、AFM、SEC 和肉眼沉淀观察。

这一层观察：

蛋白 cargo 可以使用 ELISA、Western blot、HPLC、LC–MS 或活性染色；

核酸 cargo 可以使用荧光定量、凝胶电泳、qPCR 或数字 PCR；

酶和小分子则可根据对象选择酶活、色谱或质谱方法。

这一层需要回到 cargo 原本承担的功能。例如：

胃肠稳定性实验对样品浓度、介质比例、酶活、pH 和取样方式较为敏感。正式实验前，建议先完成一张实验参数表，并在所有批次中保持一致。

处理前至少记录：

对于不同配方的比较，优先统一 cargo 剂量；若研究问题侧重载体性质，可以同时报告载体质量、颗粒数和 cargo 量。三种剂量单位共同记录，有助于识别“颗粒更多”“载体质量更高”或“cargo更多”带来的差异。

每次实验需要记录：

消化酶以活性单位进行配制，可以减少不同批次酶粉纯度差异造成的波动。INFOGEST 2.0 也将酶活测定放在正式消化实验之前。

胃蛋白酶、胰酶、胆盐和高离子强度可能影响 NTA、DLS、ELISA以及细胞功能实验。正式检测前需要完成三类预实验：

胃相或肠相样品将用于细胞实验时，取样终止方案需要提前确定。调节 pH、低温保存、加入适合后续检测的抑制剂，以及通过脱盐柱、超滤或 SEC 去除消化成分，均可作为终止方法。不同 aliquot 可以分别用于结构检测、cargo 定量和功能实验，避免一个终止步骤同时影响全部 readout。

样品浓度需要同时满足两个条件：处理后仍高于检测方法的定量下限，颗粒浓度又处于 NTA/DLS 的有效范围。

推荐的基础分组如下。

如果研究释放过程，可以再增加“free cargo与empty carrier物理混合组”。这组保留载体和cargo，却缺少预先包载或结合过程，可用于判断保护效果是否依赖真实载药结构。（这套分组结合了过程对照、组分对照和检测对照。G2控制孵育过程，G3与G5拆分cargo和载体贡献，G6与G7校正消化基质。每种对照对应一种具体替代解释，结果归因会更加稳定。）

每个正式实验建议至少包含3个独立制剂批次。每个批次的消化处理可设置2–3个技术复孔。统计分析时，独立制剂批次或独立消化实验作为生物学/实验重复单位，重复上机读数用于估计技术误差。

这条路线适合配方初筛，也与本文案例最接近。

若研究只考察酸稳定性，可以先使用无酶SGF；若研究胃相消化耐受，应加入经活性校准的胃蛋白酶。两种条件同时设置时，可以区分低pH作用与蛋白酶作用。

振荡强度需要保证样品保持均匀分散，同时减少气泡和强剪切。所有组采用相同的容器、液体体积和转速。

取样后立即进行下列处理：

终止后记录是否出现浑浊、絮状物、沉淀、颜色变化或管壁吸附。这些肉眼观察可以帮助解释后续粒径和回收率结果。

推荐同时设置：

这样可以分解储存时间、温度和胃相介质带来的变化。（pH是胃相中最直观的变量，离子强度和酶消化也会改变载体状态。先做“PBS→无酶SGF→含酶SGF”的递进比较，可以逐步定位聚集、解体或cargo损失主要由哪类环境因素触发。）

完成快速筛选后，可以让候选配方进入连续消化。以下流程采用 INFOGEST 2.0 的基本框架，正式操作时应按照实验室选定的标准版本配制电解质和测定酶活。

口腔相适合研究含淀粉基质、黏液相互作用或实际制剂吞咽过程。直接进入胃内的液体制剂可以根据研究问题简化这一阶段，并在方法部分说明原因。

胃相结束后加入肠相电解质、胰酶和胆盐，调节最终 pH 至7.0并补足体积。pH变化需要缓慢完成并持续混匀，局部高浓度碱可能短暂改变载体或cargo。

NTA适合观察单颗粒运动，并给出粒径分布和颗粒浓度。检测时需要注意：

颗粒回收率可以表示为：

其中，(N_0) 为处理前颗粒浓度，(N_t) 为相应时间点经体积校正后的颗粒浓度。

粒径变化率可以表示为：

DLS对大颗粒和聚集体较敏感，适合快速识别分布变宽和聚集趋势。建议同时报告：

胃肠介质中的蛋白、盐和胆盐会影响散射背景。样品可以在保留颗粒的前提下进行适度纯化，也可以将原始消化液和纯化后样品同时报告。

表面电荷变化可能来自质子化、胆盐吸附、蛋白冠形成或载体降解。zeta potential适合用于解释胶体稳定性变化，检测时需要保持电导率、稀释介质和温度一致。

形态学观察可以确认：

负染TEM会受到干燥和染色过程影响，适合进行组间比较；冷冻电镜更接近水合状态，但设备和样品要求更高。（NTA、DLS和TEM构成“正交结构表征”。NTA关注单颗粒粒径与数量，DLS对聚集体较敏感，TEM提供形态图像。三种方法的测量原理不同，组合使用可以减少单一仪器偏差。）

对于蛋白cargo，可以先裂解载体，再通过ELISA、Western blot或色谱测量总量。裂解条件需要经过验证，使载体充分打开，同时保留目标检测表位。

总cargo保留率：

其中，(M_0) 为处理前总cargo量，(M_t) 为相应时间点总cargo量。

ELISA结果容易受到消化液基质影响。推荐使用与样品相同的消化基质配制标准曲线，并完成低、中、高三个水平的加标回收。WB可以提供分子量信息，用于判断完整条带是否转变为低分子片段。

可以使用以下方式分离：

分离后分别测量载体组分和外部介质中的cargo，得到包载保留和释放比例。

若每次取出体积为 (V_s)，初始总体积为 (V_0)，第 (n) 个时间点的浓度为 (C_n)，累计释放量可以表示为：

累计释放率：

每次取样后是否补回等体积介质，需要在实验开始前统一。释放实验还应记录沉淀、管壁吸附和cargo降解，因为它们都会造成质量回收不足。

根据cargo类型选择：

功能实验是整套protocol中最接近治疗意义的一层。它需要使用经历完整胃肠处理的样品，并让free cargo经历完全相同的处理、终止和纯化过程。

进入细胞实验前，需要完成：

样品净化方式需要同时考虑cargo回收和功能保持。SEC、脱盐柱或适当MWCO的超滤通常比长时间透析更适合小体积快速处理，但具体选择取决于载体大小和cargo性质。

以FGF2类生长因子为例，可以按作用路径逐层设置：

受体和早期信号通常在分钟到小时尺度变化；增殖、迁移和组织修复需要更长观察时间。时间点根据作用层级分别设置。

其中，(E_t) 为处理后样品效应，(E_0) 为未处理样品效应，(E_blank) 为相同消化和净化流程后的空白效应。

如果功能readout存在明显的非线性剂量反应，建议先建立cargo标准曲线，再将处理后效应换算为“功能等效浓度”。这种表示方式比单点百分比更适合比较不同批次和不同配方。（背景受体磷酸化属于近端功能readout，受到的旁路影响相对较少；细胞增殖和迁移属于远端表型，会同时受到营养、毒性和载体本身影响。将近端信号和远端表型组合，可以同时观察cargo是否被激活以及这种激活能否传递到细胞功能。）

完成结构、cargo和功能三层检测后，可以按以下矩阵判断失效位置。

这张矩阵也能帮助确定下一轮优化方向。粒径变化主要把问题推向胶体稳定性；cargo量下降把问题推向泄漏或降解；功能下降则需要检查构象、受体结合或净化过程。（结果判读在这里形成分支。研究者根据三层readout的组合定位失效环节，再决定优化载体、包载、释放还是cargo保护。实验由此推进到“解释配方为什么失效”。）

适合配方筛选或研究早期：

这套组合能够初步判断载体是否提高cargo在胃相处理后的保留和功能。

适合形成完整研究结果：

适合进一步研究递送机制：

实验记录中还应保留酶批号、实测活性、消化液批次、样品批次、振荡参数、终止方法、稀释倍数和原始仪器文件。

口服纳米载体经历胃肠环境后，载体结构、cargo含量和cargo功能可能沿着不同方向变化。结构表征描述颗粒发生了什么，cargo定量与完整性检测说明活性分子保留到什么程度，功能实验进一步确定这些分子还能否产生预期作用。

将三层readout放进同一套实验，研究者可以定位保护作用、释放阶段和失效环节。快速压力筛选负责挑选候选配方，胃—肠连续消化负责检验完整过程，近端信号与远端表型则把理化稳定性连接到生物功能。整套protocol由此形成一条从模拟环境、过程取样到功能验证的连续证据链。