从减重到跨血脑屏障：应用版图、靶点设计与层析纯化全景

导语  当抗体提供“导航”和长半衰期，多肽提供受体激动、通路阻断、组织穿透或蛋白降解等功能，一个新的药物设计空间就被打开了。但把两者接起来只是第一步：真正决定一条 APC 管线能否从漂亮的活性曲线走向稳定生产的，往往是后半程——如何从未偶联抗体、不同肽抗比、游离多肽、错配体和聚集体中，稳定地拿到目标物种。

本文讨论的 APC 是antibody-peptide conjugate，抗体-多肽偶联物。它不是“用多肽免疫动物获得的抗肽抗体”，也不是以多肽作为靶向配体、携带小分子毒素的 PDC。为了让研发、生产和纯化人员都能读懂，本文先用约三分之一篇幅讲清结构、机制、设计和产业进展，再把重点放在制造工艺，尤其是层析开发的判断逻辑、可迁移条件、风险和放大路线。

一、先别急着把 APC 当成“换了弹头的 ADC”

ADC 的经典逻辑是“抗体把高毒小分子送到目标细胞”，而 APC 的多肽通常不只是被动载荷。它可以是受体激动剂、离子通道抑制肽、蛋白酶抑制肽、细胞穿透肽、组织归巢肽、抗原表位、掩蔽肽，甚至是把膜蛋白引向溶酶体降解的功能模块。于是 APC 的作用位置既可能在胞内，也可能在细胞膜、细胞外基质或循环系统。

这带来三个直接后果。

第一，肽抗比（peptide-to-antibody ratio，PAR）不能机械照搬 ADC 的 DAR 经验。多肽往往比小分子载荷更大，具有更复杂的二级结构、净电荷和氢键网络。PAR 从 2 增至 4，不只是“多装两个药”，还可能改变整个偶联物的表面电荷、疏水斑块、黏度和自缔合倾向。

第二，偶联位点是药理设计的一部分。多肽需要接触膜受体或离子通道时，靠近 Fab 末端或轻链的位点可能提高局部可及性，却也可能增加非特异性组织结合和清除；接在 Fc 区通常更利于保护抗体结合功能和平台化生产，但空间几何未必最优。

第三，下游纯化的任务从“除小分子”升级为“分辨高度相似的大分子物种”。未偶联抗体与目标 APC 的分子量差可能只有几个百分点；PAR1 与 PAR2 的尺寸差别更小，却可能在疏水性、电荷和构象稳定性上产生足以影响效力、PK 和免疫原性的差异。

APC 的三类产品逻辑

类型	谁是主要药效模块	典型价值	代表性研究
递送型	多肽	抗体负责靶向和延长半衰期，多肽负责药效	NaV1.7 抑制肽-抗体偶联物、抗体-非天然肽蛋白酶抑制剂
增强型	抗体	多肽改善穿透、归巢或条件性激活	αPD-1-(iRGD)2、SynB1-抗狂犬病抗体、肽掩蔽抗体
双功能型	抗体和多肽均有药效	两条通路同时调节，形成真正的多特异功能	MariTide、历史项目 rozibafusp alfa

边界需要说清：融合表达的“抗体-肽融合蛋白”、化学偶联的 APC、糖链重塑后连接多肽的 APC，在药理上可以属于同一大类，但在 CMC 上是三种不同问题。融合表达物首先面对宿主细胞表达、剪切和装配；化学偶联物面对反应残留与 PAR 分布；糖链偶联物还要控制去糖基化、糖链重构和酶残留。讨论工艺时必须先声明分子来源。

二、一个 APC 分子的四个旋钮

1. 抗体：不仅是“导航头”

全长 IgG 通过 FcRn 回收获得长循环时间，还能保留或消除 FcγR/补体效应。肿瘤免疫项目可能希望保留 ADCC，代谢病或慢病项目则常需要效应沉默。Fab、scFv、VHH 可以降低分子尺寸、提高组织渗透，却会失去部分长半衰期优势，并改变过滤、Protein A 捕获与聚集行为。

选择抗体时，除了亲和力，还应在早期建立“可制造性画像”：pI、疏水斑块、热稳定性、低 pH 耐受性、自相互作用、氧化/脱酰胺敏感位点、Fc 糖型以及是否存在易被偶联条件扰动的二硫键。对 APC 而言，抗体原液的“平台可制造性”只是起点；偶联后应重新测一次，因为多肽可能把原本稳定的 mAb 推入新的胶体稳定性区域。

2. 多肽：活性之外还要看电荷、疏水性和化学稳定性

多肽的序列决定药效，也决定纯化难度。正电荷密集的细胞穿透肽容易发生非特异性膜结合、肝摄取和层析介质吸附；疏水或含芳香残基的肽会明显提高 HIC 保留，并放大高 PAR 物种的聚集风险；含 Met、Trp、Cys 的序列要评估氧化和错配二硫键；Asn-Gly、Asp-Gly 等序列还可能带来脱酰胺或异构化。

NaV1.7 抑制肽 JzTx-V 的研究是一个非常有价值的提醒：高活性、高正电荷的肽与抗体偶联后出现较短的血浆暴露和肝脏蓄积；把肽的形式电荷从 +6 降至 +2，在保持活性的同时使啮齿类暴露提高了 18 倍。^[1]这说明“降低碱性”既是 PK 优化，也是后续 IEX/HIC 可开发性优化。

3. 连接子：稳定不是唯一目标

不可切割连接子适合希望整体分子在胞外或膜表面持续发挥作用的项目；可切割连接子则利用溶酶体蛋白酶、酸性 pH、还原环境或肿瘤相关蛋白酶释放肽或解除掩蔽。连接子长度决定空间可及性，亲水性影响溶解度和 HIC 保留，刚柔性影响肽构象，连接位点附近的电荷还会改变 CEX/AEX 行为。

经典maleimide-thiol 反应方便，但需关注逆 Michael 反应、与白蛋白 Cys34 的交换以及琥珀酰亚胺环水解。对于长期给药 APC，更应把“血浆中连接稳定性”作为独立 CQA，而不是只看放行时的完整度。

4. 偶联位点与 PAR：均一化是一种风险控制

随机赖氨酸偶联简单，却可能产生几十个位置异构体；链间二硫键部分还原可形成多种载荷数和连接拓扑。位点特异性路线包括工程化 Cys（THIOMAB）、Fc 亲和肽引导的 AJICAP、mTGase、sortase、糖链重塑、非天然氨基酸和点击化学等。

Junutula等人的 THIOMAB工作证明，位点特异性低 DAR ADC可在不牺牲体外活性的情况下改善安全窗，为 APC 的均一化思路奠定了基础。^[2]但“位点特异”不等于“成品天然均一”：反应转化率、去保护、酶切、氧化还原和原料质量仍会留下 PAR0、PAR1、未完全反应中间体和位置异构体，因此纯化仍不可省略。

三、APC怎样起效：四种机制，对应四套 CMC 重点

图1｜APC 的四类机制。左上：受体介导内吞并释放肽；右上：抗体与多肽同时作用于两个受体；左下：穿透/归巢肽帮助抗体进入组织；右下：蛋白酶切除掩蔽肽后恢复抗体结合。图为原创示意，非按比例绘制。

内吞释放型需要关注内吞速率、连接子切割、溶酶体稳定性和游离肽的胞内可达性。若肽本身不易跨越溶酶体膜，仅仅把它送进细胞并不等于能到达胞质靶点。

双通路型的代表是 maridebart cafraglutide（MariTide，AMG 133）：全人源抗 GIPR 拮抗抗体连接两个 GLP-1 类似物，兼具 GIPR 拮抗和 GLP-1R 激动作用。^[3]其关键 CQA 不只是 PAR，还包括两条通路的相对效力与批间耦合关系。到 2026 年，Amgen 已将其推进至 MARITIME III 期计划。^[4]

穿透增强型正在从概念走向更有说服力的动物证据。糖工程构建的 αPD-1-(iRGD)2 在多种同系小鼠肿瘤模型中改善组织穿透并同时连接肿瘤细胞与 PD-1 阳性 T 细胞。^[5] 2025 年报道的 SynB1-抗狂犬病抗体组合物在症状出现后给药，使致死攻击小鼠的存活率达到 80%，而未偶联抗体组合在两种病毒株下仅为 20% 或 0%。^[6]这些结果令人兴奋，但仍属于临床前证据，不能直接外推人体疗效。

条件激活型用多肽遮蔽抗体结合位点，到达富含特定蛋白酶的病灶后解除遮蔽。它最怕“过早切开”和“切不开”：前者失去安全性优势，后者失去药效。因此要同时建立完整 APC、去掩蔽抗体和切下游离肽的定量方法。

新机制也在出现。2024 年报道的 Ab-CMA 把识别伴侣介导自噬的肽连接到抗体上，使 EGFR、PD-L1、HER2 等膜蛋白进入溶酶体降解；另有研究将非天然肽蛋白酶抑制剂靶向递送到肿瘤和破骨细胞环境。^[7,8]这意味着 APC 正从“载药”扩展为“编程蛋白命运”的分子工具。

四、从减重到跨血脑屏障：APC 的应用版图正在怎样展开

图2｜APC 的治疗领域与应用场景。中心为位点特异连接功能肽的 IgG，外围依次概括代谢调控、肿瘤免疫、血脑屏障递送、神经感染、外周疼痛、自身免疫和抗原定向递送。该图用于展示“药理任务”，不代表所有方向均已进入临床。

APC 最有价值的地方，不是简单把多肽“做长效”，而是让抗体和多肽分别承担不同任务：抗体可以提供半衰期、细胞选择性、组织定位或第一条药理通路；多肽则负责受体激动、酶抑制、穿膜、组织归巢、抗原呈递或条件激活。按应用场景看，目前可以归纳为七条主线。

1. 代谢与肥胖：最接近产业化验证的双通路 APC

MariTide是这一领域的标志性案例。分子以抗 GIPR 拮抗抗体为骨架，位点特异连接两个 GLP-1 类似物，一边抑制 GIPR，一边激动 GLP-1R，并利用 IgG 延长体内暴露。Amgen 在 2026 年一季度材料中披露，MARITIME-1 III 期持续进行，且已启动或规划多项慢性体重管理与 2 型糖尿病 III 期研究。^[3,4]这类设计的核心不是把 GLP-1 肽装得越多越好，而是维持两条通路的效力比例、抗体拮抗活性、PAR2 均一性和长期血浆稳定性。

2. 肿瘤：从“送进去”走向“改变微环境和蛋白命运”

肿瘤方向至少包含四种思路。其一，αPD-1-(iRGD)2 利用 iRGD 先结合 αv 整合素、经蛋白酶切割后暴露 CendR 基序并与 NRP1 相互作用，从而增加肿瘤穿透，同时保留 PD-1 免疫检查点阻断。^[5]其二，非天然共价肽抑制剂分别针对 cathepsin B/S/K/L，再与识别 CD22/CD79、HER2 或 SIGLEC-15 的内吞抗体组合，将蛋白酶抑制限制在淋巴瘤细胞、乳腺癌细胞或破骨细胞相关区室；该工作已显示体内外疗效，但仍是临床前平台。^[8,25]其三，Ab-CMA 使用 KFERQ 类伴侣介导自噬识别肽，把 EGFR、PD-L1、HER2 等膜蛋白牵引至溶酶体降解。^[7]其四，pH 敏感穿膜肽可在酸性肿瘤微环境插膜并锚定抗体 Fc，借助 ADCC 扩大对缺乏高特异表面抗原肿瘤的覆盖；中国专利 CN106822863A 披露了利妥昔单抗/Fc 等构型及小鼠黑色素瘤、乳腺癌研究。^[24]

3. 中枢与感染：肽不再是药效载荷，而是“过关通行证”

SynB1-抗狂犬病抗体组合把细胞穿透肽连接到识别不同病毒糖蛋白表位的三株中和抗体上，目标是让抗体跨越血脑屏障、到达已感染神经组织；症状出现后给药仍在小鼠中产生显著生存获益，但尚不能外推为人体疗效。^[6] JCR/PeptiDream 的专利族则使用人 TfR 结合环肽作为 BBB shuttle，实施例将其连接到曲妥珠单抗或纳武利尤单抗，hTfR-KI 小鼠脑组织暴露高于裸抗体；这是“专利实施例/动物证据”，不是临床管线结论。^[11,26]

4. 疼痛：离子通道肽需要先被“去毒化式工程”

蜘蛛毒素来源的 JzTx-V、GpTx-1 等肽能够高效抑制 NaV1.7，理论上适合外周镇痛；抗体在这里主要承担长半衰期载体，而非额外治疗靶点。真正的难题是高正电荷和疏水表面会造成非特异组织结合与肝摄取。JzTx-V 研究将形式电荷从 +6 降到 +2，在保留活性的同时使啮齿类血浆暴露提高 18 倍，说明“肽序列可制造性”必须在偶联前解决。^[1]

5. 自身免疫：双重阻断有逻辑，但临床失败同样有信息价值

Rozibafusp alfa（AMG 570）把抗 ICOSL 抗体与 BAFF 抑制肽组合，试图同时压制 T 细胞共刺激和 B 细胞存活信号。该项目曾进入 SLE IIb 期，但 Amgen 于 2023 年披露因无效性中止。^[9]它提醒行业：双功能分子并不天然产生临床协同；除分子质量外，还要证明疾病人群中两条通路同时活跃、剂量下的组织暴露匹配，并建立可解释的药效生物标志物。

6. 治疗性疫苗与抗原递送：抗体负责“把肽交给正确的 APC”

抗 CD11b VHH 通过 sortase位点特异连接 HPV16 E7 49–57 表位肽，可将抗原定向递送给 CD11b 阳性抗原呈递细胞，在小鼠中增强 E7 特异 CD8+ T 细胞、肿瘤浸润和生存获益。^[27]另一种 2025 年报道的非共价平台在抗 CD40 抗体 C 端融合带负电的 E-domain，再用互补 K-domain 携带 SIINFEKL；混合后形成可解离的 coiled-coil 抗体-抗原肽复合物，并增强交叉呈递。^[28]这类构型在药理上属于 APC，但在 CMC 上可能是共价偶联物、融合蛋白或组装型复合物，纯化策略不能混为一谈。

图3｜多肽类型—抗体靶点—设计目的地图。图中八类角色跨越 III 期、已终止临床、临床前和专利平台。它回答的不是“哪个靶点最好”，而是“多肽承担什么功能、抗体把它带到哪里、偶联后要解决哪一个药理矛盾”。

多肽类型、抗体靶点和设计方式对照

多肽类型与特点	代表多肽	抗体靶点/骨架	偶联与设计要点	治疗领域/证据状态
受体激动肽；效力高但半衰期短	GLP-1 类似物	抗 GIPR 拮抗抗体	工程 Cys/非天然位点，目标 PAR2；保持双通路效力比例	肥胖、T2D；III 期
配体抑制肽；需维持结合构象	BAFF 抑制肽	抗 ICOSL	双功能阻断；需证明组织暴露与通路协同	SLE；IIb 因无效性终止
离子通道抑制肽；常富含 Cys、正电荷高	JzTx-V、GpTx-1	半衰期载体抗体	降低碱性与非特异结合；保护二硫键折叠	外周疼痛；临床前
非天然共价酶抑制肽；含反应   warhead	Cathepsin B/S/K/L 抑制肽	CD22/CD79、HER2、SIGLEC-15	选择内吞靶点，送至溶酶体后局部封锁蛋白酶	肿瘤/骨病；临床前
肿瘤穿透/归巢肽；依赖受体与蛋白酶顺序	iRGD	PD-1	Fc 糖链位点连接 2 个 iRGD；兼顾免疫阻断与穿透	实体瘤；临床前
BBB/细胞穿透肽；易带正电和非特异摄取	SynB1；人 TfR 环肽	抗狂犬病抗体；HER2/PD-1 等示例抗体	控制肽数、连接臂长度和血浆稳定性；验证脑/血比	神经感染、中枢递送；动物/专利
抗原表位肽；短、易降解、需交叉呈递	HPV16 E7 49–57；SIINFEKL	CD11b VHH；CD40	sortase 共价连接或 coiled-coil 组装；确保抗原可加工	治疗性疫苗；临床前
CMA 降解肽；含 KFERQ 类识别基序	CMA targeting peptide	EGFR、PD-L1、HER2 抗体	诱导内吞和溶酶体降解；需区分抗体阻断与降解效应	肿瘤；概念验证
pH 敏感穿膜肽；酸性条件插膜	pHLIP 类肽	IgG/Fc，专利示例含利妥昔单抗	肿瘤酸性环境锚定 Fc，保留   FcγR/ADCC	实体瘤；专利/动物研究
掩蔽肽；降低正常组织结合	可切割 masking peptide	EGFR、PD-L1 等高表达但非肿瘤特异靶点	连接子须在病灶切开；同步定量完整、去掩蔽和游离肽	肿瘤安全窗；平台/临床探索

这张表还揭示一个经常被忽视的边界：Val-Cit、Val-Ala、GGFG 等“肽连接子”不等于功能性多肽载荷。它们的主要任务是控制 ADC/APC 的稳定与释放，不应仅因含有氨基酸就被统计为 APC 药效肽。相反，iRGD、SynB1、TfR 环肽和 KFERQ 类肽即使不直接杀伤细胞，也会主动改变组织分布、内吞或蛋白命运，属于真正的功能模块。

对分子设计团队，一个实用的决策顺序是：先写清多肽角色，再选抗体靶点，最后确定偶联位点和 PAR。若多肽需要接触膜受体，连接臂过短或靠近 Fab 可能产生空间遮挡；若多肽高疏水、高正电，则优先选择低 PAR、Fc 端对称位点和亲水连接臂；若依赖内吞，则抗体靶点要有足够内吞速率和正确的胞内分选；若目标是 BBB shuttle，则必须同时监测脑暴露、外周 PK、TfR 竞争和脑毛细血管滞留，而不能只看总脑组织信号。

五、产业与专利：临床很窄，技术边界正在变宽

对 APC 的产业判断应避免两个极端：既不能因为 MariTide 热度高就宣称“赛道已经成熟”，也不能因为获批产品尚少就忽略其平台价值。更准确的图景是：产品端仍以少数临床项目为锚，专利端和技术平台端已开始多点布局。

主体/地区	布局	当前判断（截至2026年7月）
Amgen / 美国	MariTide；GIPR 抗体-GLP-1 肽专利族	MariTide 为最清晰的临床领先者，已进入 III 期；US10905772B2 等专利覆盖代谢病用途与分子组合
Amgen / 美国	rozibafusp alfa（AMG   570）	曾作为 ICOSL 抗体-BAFF 抑制肽双功能 APC 进入 SLE IIb 期，但研究因无效性停止，不宜列为活跃成功管线[9]
恒瑞医药 / 中国	WO2025140617A1 抗体-多肽偶联物	2025 年公开的 PCT 申请，显示国内企业已把 APC 纳入分子与用途专利布局；公开不等于获批或临床验证[10]
PeptiDream + JCR / 日本	人 TfR 结合肽-抗体偶联物	WO2023027125 同族进入美国、欧洲、中国等国家/地区阶段；实施例公开多种 UF/DF 纯化条件，体现 BBB/组织递送方向[11]
Ajinomoto Bio-Pharma / 日本-美国	AJICAP 位点特异偶联及 HIC 工艺	更偏使能技术与 CDMO 能力，为均一化和工艺放大提供工具，而非单一 APC 药物管线[12]
Genentech/Roche、CytomX 等 / 美国-欧洲	工程化 Cys、肽掩蔽抗体等	构成 APC 可借用的底层偶联与条件激活技术；需区分平台相关性与直接 APC 产品归属

新增专利进一步显示，竞争焦点正在从“某一个肽”扩展到“如何让肽改变抗体行为”。WO2024119049A1 披露用 stapled Magainin 或阳离子 promoter peptide 促进 CD38、CD20、HER2、HER3、EGFR、FRα 等抗体内吞，并允许进一步叠加小分子载荷；CN114533895A 则用 Fc 亲和肽把反应基团定向带到 IgG Fc，属于位点选择工具；cathepsin 抑制肽团队公开的 PCT/EP2022/073211 更侧重非天然共价肽抑制剂本身；US20200188528A1 则覆盖可切割、pH 响应的 peptide-antibody compositions。[29-32] 这些权利要求分别覆盖“递送行为、偶联方法、肽药效结构和释放机制”，也提示未来 FTO 不能只检索抗体靶点。

专利检索还显示，欧洲和日本市场常通过 PCT 同族承接同一核心发明。例如 JCR/PeptiDream 的 TfR 肽-抗体偶联物对应 EP4393959A1、US20240366775A1 和 CN118201966A；Amgen 的GIPR/GLP-1 组合在美国已授权，并有日本等同族。专利“布局”只说明权利要求和地域意图，法律状态、保护范围、自由实施空间仍需专业 FTO 分析，不能把 Google Patents 的自动状态当作法律意见。

未来五年更值得关注的不是“会不会复制 ADC 的上市数量”，而是四个方向：一是长效代谢多肽与抗体组合；二是 BBB/组织穿透；三是条件激活与免疫微环境重塑；四是借助肽实现膜蛋白降解或酶活性局部封锁。它们共同要求 CMC 从平均 PAR 管理，升级到位点、载荷数、构象、电荷、疏水性和生物活性多维一致性管理。

六、真正的制造起点：先画清“产品与杂质地图”

一条可放大的 APC 工艺通常由三条供应链汇合：抗体原液、多肽-连接子原料和偶联/后处理平台。任何一条线不稳定，最终层析都会变成救火工具。

1. 抗体原液

若 APC 采用化学偶联，抗体 DS 通常已完成 Protein A、病毒灭活、抛光和病毒过滤。进入偶联前仍需确认浓度、缓冲体系、游离巯基、C 末端 Lys、糖型、聚集体和微量金属。某些常见辅料会干扰反应：Tris 含伯胺，可竞争 NHS 酯；组氨酸和某些抗氧化剂可能影响氧化还原或金属催化；高浓度聚山梨酯可能改变反应界面和分析保留。

2. 多肽及连接子

合成多肽通常经 SPPS、切割脱保护、沉淀、制备型 RP-HPLC 和冻干。用户提供的两篇“peptide antibodies”文献主要讨论以合成肽制备/纯化抗体的经典方法，它们与治疗性 APC 不是同一概念，但对肽原料的抗原性、载体连接和 RP-HPLC 纯化仍有历史参考价值。^[13,14]

多肽原料放行至少应覆盖身份与序列、主峰纯度、异构体/缺失肽、氧化体、二聚体、残余溶剂、TFA/乙酸根、含水量、内毒素和生物负载。若带反应基团，还要测活性基团含量，而不是只用总肽含量代替。

3. 偶联反应

典型流程包括抗体预处理、位点暴露或酶切、还原/再氧化、肽-连接子加入、淬灭与保温。CPP 可用 pH、温度、抗体浓度、肽/抗体摩尔比、共溶剂比例、还原剂当量、溶氧和反应时间描述。高浓度有利于缩小设备体积，却会增加局部过量、黏度和聚集；DMSO、DMA 或 IPA 有助于溶解疏水肽，却可能降低抗体构象稳定性。

4. 先画杂质，再选单元操作

杂质/CQA	来源	最有效的分离维度	常用方法
游离多肽、连接子、还原剂、溶剂	反应过量与副产物	尺寸	TFF/UFDF、SEC（小规模）
未偶联抗体（PAR0）	转化不完全	疏水性或电荷	HIC、混合模式、部分 IEX
不同 PAR 物种	反应统计分布	疏水性为主	HIC/HIMC；必要时制备 SEC 或 IEX
位置异构体/错配体	随机偶联或二硫键重排	局部疏水、电荷、构象	HIC、IEX、混合模式；分析用 LC-MS/肽图
聚集体	反应、盐析、界面和层析诱导	尺寸、疏水性	SEC、AEX/CEX、HIC 流穿、膜层析
酶与亲和试剂残留	mTGase、糖苷酶、sortase、Fc 亲和肽	尺寸/电荷/亲和	TFF、IEX、亲和/混合模式

这张表决定工艺顺序。若主要问题只是游离肽，先做 TFF 通常最经济；若必须去除 PAR0/富集 PAR2，TFF 无能为力，应尽早引入 HIC 或混合模式；若高盐 HIC 会让分子聚集，就应探索流穿模式、膜层析或先用电荷维度减负。

七、平台化下游路线：TFF先减负，层析做真正的选择

图4｜APC HIC 的分离逻辑。高盐削弱蛋白水化并增强与疏水配基的作用；通常 PAR0 最弱，高 PAR 和聚集体更强。降低盐浓度并加入温和有机改性剂后依次洗脱，随后用 UF/DF 换入制剂缓冲液。实际洗脱顺序取决于肽的疏水性、电荷和偶联位点，图为原创示意。

一个可作为起点、但不能机械套用的流程是：

1. 反应淬灭与澄清：低速离心或 0.45/0.22 μm 预过滤，尽快除去可见颗粒。

2. TFF-1：用 30-50 kDa MWCO 膜去除游离肽、连接子、小分子试剂和共溶剂，并换入层析上样缓冲液。

3. 选择性层析：HIC/HIMC 用于 PAR 与疏水异质体；IEX/混合模式用于电荷变体、酶残留和聚集体。

4. TFF-2：脱盐、浓缩并换入制剂缓冲液。

5. 0.22 μm 除菌过滤与灌装。

这一路线的核心是“正交性”。TFF 解决尺寸差异，HIC 解决疏水差异，IEX 解决电荷差异；如果连续两步都只靠同一分离维度，工艺表面复杂，真实鲁棒性却未增加。

TFF/UFDF：看似简单，最容易被低估

专利WO2023027125 的 APC 实施例给出了直接条件：30 kDa MWCO Amicon Ultra-4，以 100 mM HEPES pH 7.8 加至 4 mL、5000 g 离心 15 min，重复三次；另有 10%-20% 乙酸、pH 2.0 的换液方案，再以 100 mM HEPES pH 8.5 回调。^[11]这些是实验室条件，不宜直接视为生产处方，尤其 pH 2.0 暴露可能诱导 IgG 部分展开、聚集或肽降解。

放大时要关注膜材质、MWCO、跨膜压（TMP）、剪切、通量衰减、浓差极化和肽的膜吸附。建议用“洗滤体积 DV-残留小分子曲线”确认清除，而不是规定固定 DV 后假设完成。对于强疏水肽，还应做膜前后总物料衡算，避免游离肽黏在膜上造成虚假的高去除率。

八、HIC深潜：为什么它最适合分 PAR，也最容易把项目做崩

1. 原理不是“疏水的就晚出来”这么简单

高盐降低蛋白表面的水化，促进疏水斑块与烷基/芳香配基接触。PAR 增加通常提高疏水性，因此 HIC 能把 PAR0、PAR1、PAR2 拉开。但保留还受肽的芳香残基、正负电荷、连接子 PEG 长度、偶联位点暴露、抗体构象和聚集状态影响。同样是 PAR2，若两个肽位于不同部位，也可能出现不同峰。

盐种遵循 Hofmeister 效应。硫酸铵盐析能力强、常提供更强保留，但对疏水 APC 可能导致不可逆结合或沉淀；NaCl 较弱，分辨率可能下降，却常能提高回收并降低聚集风险。IPA、乙二醇、丙二醇等改性剂可减弱疏水作用并改善峰形，但必须同时验证抗体稳定性、可燃溶剂管理、膜兼容性和后续清除。

2. AJICAP案例：一组非常值得“拆开看”的数据

Matsuda 等以曲妥珠单抗-AJICAP-MMAE 作为模型，在 AKTA Pure 上使用 0.8 × 10 cm、5 mL 的 TOYOPEARL Phenyl-650S 柱。柱以 3 CV 的 A 液平衡：50 mM 磷酸钠、2 M NaCl、pH 7.0；2.5 mL、20 mg/mL 的粗 ADC 与等体积 A 液混合后上样；B 液为 50 mM 磷酸钠、20% v/v IPA、pH 7.0，以 A 到 B 的线性梯度洗脱。^[12]

结果不是简单的“Phenyl最好”，而是一组相互制约的证据：

树脂	结果	回收	工艺解释
TOYOPEARL Phenyl-650S	PAR/DAR 物种可分离	65%	配基强度处在可分辨又可洗脱的窗口
TOYOPEARL Butyl-650M	30% IPA 仍未洗脱	未报告	结合过强，说明“更疏水”不等于“更好”
TOYOPEARL PPG-600M	未分离	72%	回收较高但选择性不足，不能完成目标物种富集

该工艺让未偶联抗体（DAR0）在上样后流穿，DAR1 和 DAR2 随梯度洗脱；在 12、20、50 mg 三种样品规模上，回收与分离表现相近。纯化后 DAR1、DAR2 物种经 HIC 和 Q-TOF MS 验证为均一；SEC 显示聚集体低于 3.5%。DAR1 与 DAR2 对 HER2 高表达 HCC-1954 细胞的 IC50 分别为 0.18 和 0.12 nM，对 NCI-N87 分别为 0.24 和 0.12 nM，而对 HER2 低表达 PC3 均大于 30 nM。^[12]

这组数据可迁移到 APC 的是开发逻辑，不是处方本身：

·先用较弱盐和中等疏水配基找到“可逆结合窗口”；

·把回收率与分辨率分开评价，PPG 的 72% 回收并不代表合格；

·同时用 SEC 看高盐/IPA 是否诱导聚集；

·用正交方法确认 PAR，避免把 HIC 峰面积直接当作绝对 PAR 真值；

·最终要用生物活性证明层析没有选择出“分析上漂亮、功能上变弱”的构象群体。

3. APC的HIC筛选矩阵

建议先做小体积批式结合或 1 mL 预装柱筛选，再进入 DoE。第一轮变量可设为：

·配基：Butyl、Phenyl、PPG/ether 以及低配基密度版本；

·盐：0.5-2.0 M NaCl、0.3-1.2 M 硫酸铵，必要时柠檬酸盐；

·pH：通常 5.5-7.5，避开分子低稳定性区；

·改性剂：0-20% IPA，或 0-30% 乙二醇/丙二醇；

·温度：室温与低温；

·负载：0.5-20 mg/mL resin 的动态窗口。

响应值至少包括目标物种回收、PAR0 去除、目标 PAR 纯度、聚集体、主峰拖尾、峰间分辨率、池体积和后续 TFF 负担。仅盯分辨率会把开发推向高盐、长梯度和低产能；仅盯回收又会得到 PPG 案例那样“洗出来了但没分开”的结果。

4. 梯度转阶梯：从分析漂亮到生产可控

线性梯度适合寻找窗口，生产更偏好阶梯洗脱：上样后用低强度洗液带走 PAR0，再以中等强度洗出目标 PAR，最后用高强度溶液清除高 PAR/聚集体。阶梯边界应围绕关键峰的保留体积与缓冲液配制误差设置安全余量。

放大时维持柱床高度、线速度、停留时间和单位树脂负载，并重新评估系统外体积。IPA 会改变黏度、UV 基线和密度；高盐会提高电导并带来配液、腐蚀、废液和清洁负担。对于高价值低批量 APC，可以接受较低产能换取纯度；慢病大剂量产品则必须从一开始计算树脂体积、缓冲液吨位和溶剂回收，否则实验室最优条件可能完全没有商业可行性。

5. 五类常见失败及排查

不上柱。可能是盐浓度不足、配基太弱或样品中亲水辅料过多。先提高离子强度或换 Phenyl，而不是直接用更强 Butyl。

全粘住。可能是肽过疏水、配基密度高或盐析过强。优先降低盐、改用 NaCl、降低配基强度、增加乙二醇/IPA，并用短接触时间确认是否存在不可逆构象变化。

PAR峰挤在一起。降低梯度斜率、调整 pH 和盐种，或利用 IEX/混合模式增加第二维度。不要只靠无限拉长柱子解决。

回收低但SEC正常。关注不可逆树脂吸附、系统管路吸附和池切割过窄；做整柱物料衡算与 CIP 洗脱分析。

回收高但聚集升高。可能在上样高盐、柱上长停留或有机改性剂切换时发生。缩短停留、降低蛋白浓度、加入适宜稳定剂，并把聚集体在线形成与原料带入区分开。

九、不只有HIC：IEX、混合模式、SEC和膜层析怎样组合

离子交换层析

CEX/AEX 对多肽引入的净电荷变化非常敏感。若肽为强碱性 CPP，偶联后 pI 上移，CEX 保留会增强；酸性肽可能使 AEX 选择性更明显。IEX 常能同时降低宿主残留、核酸、内毒素、酶残留和部分聚集体，回收率也通常高于强结合 HIC。

挑战是“电荷异质性叠加”：抗体自身 C 末端 Lys、脱酰胺、糖化和唾液酸变体会与多肽偶联造成的电荷差混在一起。于是一个多峰 CEX 图不一定代表多个 PAR，也可能是同一 PAR 的抗体电荷变体。用户目录中的多篇 mAb 文献进一步提示，CEX 柱上可能发生可逆自缔合、表面诱导展开、非可逆聚集或由组氨酸质子化造成的双峰/三峰洗脱。对结构边缘稳定的 APC，必须做负载、停留时间、温度和盐浓度依赖性实验，避免把“柱上生成的峰”误判为原液杂质。

混合模式层析

混合模式同时利用离子、疏水和氢键作用，适合 HIC 需要过高盐或 IEX 选择性不足的分子。开发难度在于参数耦合，pH 和盐同时改变多种相互作用。可把它放在 HIC 前作捕获/减负，也可在 HIC 后作为低盐抛光，但应通过机制性 DoE 避免形成难以解释的窄设计空间。

SEC

SEC 对聚集体和片段直观，实验室制备也温和，但装载低、池体积大、放大昂贵，一般更适合作分析放行或小规模救援，而非主生产步骤。SEC 分析 APC 时还要防止疏水和静电二次相互作用导致假拖尾；可通过提高离子强度、加入精氨酸或选择合适有机改性剂优化，但每个添加剂都要验证检测与蛋白稳定性。^[15]

膜层析和连续化

HIC 膜、AEX/CEX 膜具有高流速和低压优势，适合流穿抛光。ADC 文献已报道 Sartobind S 与 Sartobind Phenyl 串联去除游离药物-连接子、聚集体并改善 DAR 分布；2025 年的一项双抗研究也显示 HIC 膜流穿可将聚集体降低约 20%。^[16]这类路线对大体积、低浓度进料尤其有吸引力，但 APC 的肽可能显著改变膜吸附，仍需实测容量和穿透曲线。

连续偶联、单程 TFF、逆流洗滤和在线缓冲液调配正在进入专利与产业视野。^[17]它们能减少持液和等待时间，但会把上游波动直接传递到下游，因此需要更强的在线浓度、电导、UV、多角度散射或快速 LC 监测。

纯化不能脱离病毒安全与设施边界

化学偶联通常发生在已经完成病毒灭活和病毒过滤的抗体 DS 之后。偶联步骤引入的多肽、酶、亲和试剂和开放操作会重新增加生物负载与交叉污染风险，却未必允许再做一次低 pH 病毒灭活，因为多肽或连接子可能不耐受。工艺设计应明确病毒安全来自抗体原液既有步骤、原辅料控制、封闭偶联系统和最终无菌过滤的组合，而不能默认 HIC 或 TFF 是病毒清除步骤。

高活性功能肽还可能触发职业暴露控制。即使多肽不像 ADC 小分子毒素那样具有极高细胞毒性，受体激动肽、毒素肽和免疫活性肽仍需基于 OEL/OEB 评估称量、溶解、取样、废液和 CIP。含 IPA 的高盐 HIC 废液同时涉及可燃有机溶剂和高电导盐负荷，必须在厂房阶段确认收集、稀释与处置能力。

制剂开发要提前介入，而不是等纯化结束

APC 的高浓度稳定窗口可能明显窄于母抗。多肽增加疏水性或局部电荷后，原抗体的组氨酸-蔗糖-聚山梨酯处方未必仍然适用。建议在候选确定前并行开展 pH 4.5-7.0、离子强度、糖/多元醇、精氨酸和表面活性剂的微量筛选，并观察冻融、振荡、光照和 2-8℃长期稳定性。

制剂缓冲液又会反过来影响末端 TFF 和除菌过滤。高黏度降低过滤通量；疏水 APC 可能吸附 PES 或 PVDF 膜；表面活性剂在剪切和冻融后可能形成颗粒。末端 0.22 μm 过滤应做产品回收、滤前后 PAR/聚集体、可萃取物/浸出物和最大过滤时间验证，而不是只看膜完整性。

十、分析控制：平均PAR远远不够

一套最低限度的 APC 分析包应覆盖：

·身份与位点：完整分子/还原亚基 LC-MS、肽图 LC-MS/MS；

·载荷分布：HIC-UV、完整质量、必要时 native MS；

·尺寸：SEC-UV/MALS、CE-SDS（还原/非还原）、AUC 或 DLS 作为开发工具；

·电荷：icIEF、CEX-HPLC；

·游离肽与小分子：RP-HPLC/LC-MS，必要时专属性残留方法；

·结构与稳定性：DSC/DSF、CD、内源荧光、粒子计数；

·功能：抗体结合、多肽受体活性、双功能细胞法、连接稳定性和血浆孵育；

·常规质量：蛋白浓度、内毒素、生物负载、残余酶、残余 Protein A/亲和肽、渗透压、pH。

AJICAP 研究中 RP-HPLC 测得的 DAR 略低于 HIC，作者认为高温和 8 M 胍盐/DTT 变性预处理可能带来降解。^[12]这正说明任何单一方法都有模型偏差。工艺开发阶段应至少用一个“基于分离行为”的方法和一个“基于质量”的方法交叉确认。

对双功能 APC，还应建立“两个功能同时合格”的效力矩阵。只测抗体 ELISA 可能看不到肽已失活；只测肽受体激动又可能看不到抗体亲和力因偶联位点受损。最好将抗体结合、肽通路和双功能细胞效应三层串联。

建立一张“工艺参数-CQA”因果图

质量源于设计，而不是终点检验。偶联反应的 pH、温度和肽当量影响 PAR 与位置异构体；TFF 的 TMP、剪切和浓缩倍数影响聚集与回收；HIC 的盐种、配基、负载和梯度影响 PAR 纯度、构象和池体积；末端换液与过滤影响浓度、颗粒和可注射性。建议把这些关系绘成因果矩阵，以风险优先数选择 DoE 因素。

一个实用的放行思路是把 CQA 分为三层：第一层是必须直接控制的身份、含量、聚集体、游离肽、PAR 分布和效力；第二层是通过工艺验证和稳定性趋势控制的低水平异构体、残余酶和溶剂；第三层是开发阶段用于理解机制的 DLS、自相互作用参数、疏水性指数和热稳定性。这样既不会把所有研究方法都塞进放行标准，也不会只凭一个主峰面积宣称产品均一。

十一、给纯化团队的开发路线图

第0阶段：用一周把问题定义对

明确目标 PAR、允许的 PAR 分布、给药剂量、预计批量和制剂浓度；拿到多肽的净电荷、疏水性、pI、二硫键与溶解度数据；对比偶联前后 SEC、HIC、icIEF/CEX和 DLS。若偶联后 HIC 保留几乎不变，就不要把 HIC 当作默认主分离。

第1阶段：高通量树脂与缓冲筛选

用 96 孔板或微型柱做树脂结合/流穿筛选，建立盐-pH-改性剂三维地图。每个条件同时测回收和选择性。把“不结合”“可逆结合”“不可逆结合/沉淀”分区，而不是只记录一个最优点。

第2阶段：单柱机制确认

用 1 mL 柱跑完整梯度，确认峰身份、池切割、质量衡算和聚集体变化。将温度、停留时间、负载提高至边界条件，判断柱上聚集和自缔合。对异常多峰做峰收集-再进样：若峰合并或互转，可能是可逆构象/缔合，而非真正化学异构体。

第3阶段：工艺整合与DoE

把 TFF 后真实进料带入，而不是继续用理想化模型样品。围绕 pH、盐、改性剂、负载、停留时间做 DoE，响应包括纯度、回收、聚集、池体积和后续可过滤性。评估树脂循环、CIP、残留和批间 carryover。

第4阶段：放大与控制策略

开展工程批，确认混合时间、缓冲液配制、在线稀释、系统梯度延迟和温度控制。定义进料接受标准与旁路策略：若 PAR0 超标，是延长反应、增加 HIC 负载，还是扩大流穿池？控制策略必须能回答偏差，而不只是描述正常批。

项目评审时最值得问的10个问题

6. 目标是平均 PAR，还是单一 PAR/单一位点物种？

7. 偶联后抗体 pI、疏水性和热稳定性各改变多少？

8. 游离多肽是否会吸附膜、管路或树脂，导致物料衡算失真？

9. HIC 的高盐暴露是否诱导可逆或不可逆聚集？

10. 目标峰在负载、pH、温度和停留时间变化下是否保持稳定？

11. HIC/CEX 多峰是化学异质体，还是柱上构象变化？

12. 层析池切割如何影响两条功能通路，而不只是主峰纯度？

13. 工艺是否能清除残余酶、亲和肽、还原剂和有机溶剂？

14. 缓冲液、盐和 IPA 用量在商业批量是否可接受？

15. 是否用正交质量方法和生物活性方法同时定义“均一”？

结语：APC的壁垒，不在“能不能接上”，而在“能不能稳定地只留下对的那一个”

APC 把抗体工程和多肽化学的优点放进同一分子，也把两边的风险叠加在同一条生产线上。它可以获得更长半衰期、更强组织定向、双通路协同和全新的降解机制；同时也可能带来电荷升高、疏水暴露、聚集、位点异质性和复杂的活性耦合。

对研发人员，最重要的启示是：从序列设计阶段就把纯化和分析纳入决策。对生产人员，最重要的是：把高盐、有机改性剂、持液、清洁和废液当作早期问题。对纯化人员，最重要的是：不要把某一根“明星树脂”当成平台答案，要用杂质地图选择正交分离维度。

MariTide证明了抗体-多肽双功能分子可以走到后期临床；iRGD、SynB1、Ab-CMA 和蛋白酶抑制肽研究展示了更宽的机制空间。下一个真正改变行业的 APC，或许不是“更高 PAR”，而是一个在药理、结构和工艺上同时被驯服的均一分子。

参考文献与专利（精选）

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说明：本文用于行业技术交流，不构成临床、投资、监管或专利法律意见。专利状态以各法域官方数据库和专业法律检索为准；文中 ADC 工艺数据用于说明可迁移的分离原理，APC 项目仍需逐分子验证。