琼脂糖凝胶电泳全攻略：从原理到跑出完美条带，一篇讲透- 大数跨境

Youlai友莱生物

2026-07-16

导读：跑电泳是分子生物学实验的“基本功”。无论你是检测PCR产物、鉴定质粒，还是分析基因组DNA，都绕不开这一步。但很多新手在跑胶时总会遇到各种状况：条带模糊、拖尾、明明有条带却怎么也跑不出来……

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我们来喽！这里小莱会不定期与大家一同分享学习分子生物领域相关内容，本期把琼脂糖凝胶电泳的原理、操作步骤和常见问题完整梳理一遍，希望能帮你少走弯路，一次跑出漂亮的条带。

一、先搞懂原理

琼脂糖凝胶电泳的核心原理并不复杂，主要靠两件事：

1. DNA带负电，会朝正极跑

DNA和RNA的骨架带负电荷。在电场中，它们会从负极（黑色插孔）向正极（红色插孔）移动。这就是为什么电泳槽的插头不能接反——接反了DNA就会往反方向跑，直接进缓冲液里，什么都检测不到。

2. 凝胶像一张“筛子”，大分子跑得慢，小分子跑得快

琼脂糖凝胶内部有密密麻麻的孔隙。核酸片段在凝胶中穿行时：

简单说就是：片段越小，跑得越快越远；片段越大，跑得越慢越近。 这就是我们分离不同大小DNA片段的基本原理。

3. 同样大小的质粒，为什么会跑出多条带？

如果你跑质粒DNA时看到不止一条带，别慌——这不一定是样品不纯。质粒在细菌中主要有三种构型：

所以同一个质粒出现2-3条带是正常现象，不同构型导致迁移速度不同而已。

4. 凝胶是怎么成型的？

琼脂糖是从红藻中提取的多糖。加热到90℃以上时，琼脂糖分子链舒展开来，形成均匀的液体；冷却到40℃以下时，分子链之间通过氢键交联，形成三维网状结构——这就是我们看到的凝胶。这个成型过程是可逆的，所以琼脂糖凝胶可以加热重新融化，方便回收胶中的DNA片段。

凝胶的孔径大小由琼脂糖浓度决定：浓度越高，孔径越小，适合分离小片段（0.2-1kb）；浓度越低，孔径越大，适合分离大片段（5-10kb）。实验室最常用的浓度范围是0.8%-1.5%。

5. 为什么能看到条带？

核酸本身是无色的，肉眼看不到。我们之所以能看到条带，是因为在凝胶中加入了核酸染料（如EB或新型无毒染料）。这些染料能特异性嵌入DNA双螺旋结构，在紫外光照射下发出荧光。DNA含量越多，条带就越亮。

二、实操步骤

从制胶到上样，一步一步来

第一步：制胶（最容易出问题的环节）

配胶：根据待分离DNA片段大小，称取适量琼脂糖，加入1×TAE或TBE缓冲液。注意液体体积不要超过锥形瓶容量的1/3，防止加热时溢出。
加热溶解：微波炉中高火加热，每30秒取出摇匀一次，直到溶液完全清澈透明、无颗粒。注意不要过度煮沸，水分蒸发会导致凝胶浓度偏高。
降温加染料：溶液自然冷却至不烫手（约50-60℃），加入核酸染料，轻柔旋转混匀，避免产生气泡。温度太高会损伤染料，太低则琼脂糖会提前凝固。
倒胶：将凝胶溶液缓慢倒入插好梳子的制胶槽中。最关键的一步：梳齿底部距离胶槽底面1-2mm，千万不能贴底！ 否则拔梳子时会戳破孔底，样品直接漏光。
排除气泡：检查梳齿间和孔底是否有气泡，如果有，用枪头或移液器吸头轻轻挑破。气泡会导致条带变形或缺失。
等待凝固：室温静置30-45分钟，等凝胶完全凝固。轻轻垂直拔出梳子，将胶放入电泳槽，倒入缓冲液刚好没过凝胶表面1mm即可。

第二步：上样与电泳

准备样品：将DNA样品与6×上样缓冲液按比例混合。上样缓冲液有两个作用：一是增加样品密度，让样品沉入孔底；二是含有示踪染料（如溴酚蓝），可以直观判断电泳进度。

上样：用移液器垂直吸取样品，枪头不要戳到孔壁，缓慢注入加样孔。每个加样孔的最大容量约40μL，不要超量。注意在凝胶左右两侧的孔中都加入DNA Marker，方便后续比对片段大小。
通电跑胶：盖上盖子，确认电极连接正确（DNA往正极跑）。常规条件：120V电压，跑约35分钟。电压不宜过高，否则会产生“笑脸条带”（两边翘起），影响结果判读。低浓度凝胶（<0.8%）比较脆弱，需要降低电压，防止凝胶融化。

第三步：成像观察

电泳结束后关闭电源，取出凝胶，放入凝胶成像系统，在紫外光下观察条带并拍照保存。

三、几个容易被忽略的细节

1.TAE和TBE怎么选？

两者都能用。TAE成本低、适合常规电泳；TBE缓冲能力强，更适合分离小片段（<1kb）。但TBE不能长时间使用，容易析出沉淀，每次最好用新鲜配制的。

2.凝胶浓度怎么定？

分离大片段（>5kb）用0.8%的胶，小片段（0.2-2kb）用1.5%的胶。浓度太高，大片段跑不进去；浓度太低，小片段容易跑出去。

3.核酸染料安全吗？

传统EB是强诱变剂，现在很多实验室已经换成新型无毒染料（如GelRed、SYBR Safe等），灵敏度和EB相当，安全性高得多。建议优先选用无毒染料。

4.Marker一定要加在两侧

方便观察电泳是否正常，也便于后续比对片段大小。

5.溴酚蓝跑到哪里合适？

溴酚蓝的迁移速度大约相当于400-500bp的DNA片段。如果你要分离的片段比这个小，就要在溴酚蓝跑到凝胶2/3处时停止电泳，否则小片段可能已经跑出去了。

四、常见问题排查

问题现象	可能原因	解决建议
加样孔有荧光残留	样品含蛋白质杂质，或基因组DNA太大无法进胶	纯化样品，或酶切处理后再跑
没有条带	上样量太少；电泳时间太长跑出去了；电极插反了；胶孔破了样品漏了；紫外光源波长不对	增加上样量；缩短时间；检查电极；制胶时注意梳齿位置；EB用254nm紫外
条带模糊拖尾	DNA降解；缓冲液用太久了；电压太高；上样量太大	用新鲜样本；换新缓冲液；降低电压；减少上样量
条带弯曲呈“笑脸”	电压过高凝胶发热不均	降低电压慢一点跑
Marker条带正常，样品没有	样品中确实没有扩增产物	检查PCR体系重新扩增
样品堵在孔里	DNA样品含蛋白质杂质；基因组DNA片段过大	纯化样品；酶切或超声打断后再跑