推荐公众号奥智生物，分享前沿组学技术、实用生信技能、数据挖掘思路
你是不是也以为，单细胞测序数据发完一篇就可以直接“杀青”进硬盘了？实际上，单细胞转录组数据绝非一次性消耗品，其蕴含的高维度信息，完全具备“一鱼多吃”的可重复分析可行性。这不仅能榨干数据的每一滴油水，更能从不同切入点揭示科学故事。
奥智生物合作客户—广医附五刘辉团队最近连发的这三篇高分标杆，就完美示范了这种操作：作者围绕肝病中经典的马洛里-登克体（MDBs）这一病理标志，用同一套单细胞核图谱打底，先通过TGF-β/JNK信号轴找出了驱动MDBs蛋白错误折叠形成的原因；接着视线一转，聚焦线粒体损伤，解析了BAX/BAK孔道如何引发线粒体微泡（MDVs）逃逸；最后阐明了释放的mtDNA如何激活巨噬细胞cGAS-STING通路、引发了无菌性炎症的微环境级联反应。通过一套单细胞数据，打通“蛋白聚集-细胞器重塑-胞间免疫通讯”三大核心机制！今天就带你解密，大佬究竟是怎样把这波科研羊毛薅到极致的！
☑️ 对照组（Control）：正常饮食作为对照；
☑️ DDC 诱导组（DDC-Fed）：0.1% DDC饮食10周诱导MDBs；
☑️ 撤药恢复组（DDC-Withdrawn）：DDC喂养10周后停药1个月使MDBs消退；
☑️ 再诱导组（DDC-Refed）：撤药1个月后再次DDC喂养7天重新诱导MDBs；
选取上述分组小鼠肝脏提核进行单细胞转录组测序，没有重复。
● 文章题目：Single-cell transcriptomic analysis reveals characteristic feature of macrophage
reprogramming in liver Mallory-Denk bodies pathogenesis[1]
作为整个系列故事的起点，第一篇文章将重点锁定在慢性肝病的核心病理标志——马洛里-登克体（MDBs）的起源上。MDBs是酒精性肝炎、代谢相关脂肪性肝炎、肝纤维化及肝细胞癌等多种慢性肝病的标志性病理结构，本质是肝细胞内的角蛋白-泛素蛋白聚集体。MDB的形成不仅反映肝细胞蛋白降解系统功能紊乱，更与肝内炎症、纤维化进展及肝癌发生高度相关，但长期以来其细胞间调控网络、驱动纤维化的具体分子机制尚不清晰，是慢性肝病靶点研发的关键科学问题。
通过单核测序，研究人员将肝脏巨噬细胞划分为四大亚群：一个单核细胞来源巨噬细胞（MDMs）亚群和三个库普弗细胞（KCs）亚群（图2 A）：
💠 脂质相关巨噬细胞（LAM，即Gpnmb+KCs）：在DDC诱导组中显著重塑并大量扩增。其主要富集在吞噬体、溶酶体及胆固醇代谢等通路。此外该亚群高表达抗炎基因。免疫荧光证实IL-7R与GPNMB在巨噬细胞中共定位，且在患 MDBs的人肝癌（HCC）临床标本中同样观察到这两种经典标记物的强免疫反应性。提示这些基因在疾病后期具有潜在的免疫抑制/保护作用（图2 B）。
💠 单核细胞来源巨噬细胞（MDMs）： 高表达Ccr2、Cx3cr1 及 MHC II 类基因（如 Cd74、H2-Ab1），富集TNF-α 通过NF-κB信号通路、IFN-γ反应等促炎通路，驱动 MDBs 的病理进展（图2 C）。
💠 Pecam1+KCs：与局灶粘附、粘附连接有关，可能调节细胞运动和巨噬细胞浸润（图2 D）。
💠 Gpnmb/Pecam1- KCs：高表达补体基因（C6、C4b）及 Timd4，参与免疫调节和代谢（图2 E）。
在上一步中发现了LAM展现出独特的免疫抑制特性。因此之后主要围绕LAM所作用的对象展开，这一部分通过大量的实验锁定了MDBs环境下肝细胞的生理特性：
💠 透射电镜观察显示，MDB形成的小鼠肝细胞中存在明显的线粒体嵴结构破坏和内质网肿胀，提示存在严重的细胞应激和线粒体功能障碍（图3 A）。
💠 在体外构建的MDB细胞模型中，检测到大量受损氧化DNA与 p62、Krt8（MDBs的标志物）共定位（图3 B）。
💠 通过巨噬细胞（Raw264.7）与Hepa1-6（肝癌细胞系）细胞的接触共培养系统证实，巨噬细胞能够吞噬由受损肝细胞释放的红色线粒体荧光标记的mtDNA（图3 C）。
镜检实验的结果提示损伤肝细胞被吞噬的机制可能是mtDNA介导的，因此下面主要开始寻找mtDNA介导巨噬细胞吞噬的核心机制：
💠 qRT-PCR结果显示DDC 小鼠肝脏中 NLRP3、ASC、IL-1β 等炎症小体组分表达上调（图4 A）。而Transwell 非接触共培养分析（仅允许小分子物质联系）中，发现受损肝细胞释放的 mtDNA 作为危险信号分子（DAMPs），激活了巨噬细胞中的 NLRP3 炎性小体（图4 B）。
💠 多重免疫组化（mIHC）进一步证实，受损的 8-OHdG DNA 与巨噬细胞中的 ASC 斑块共定位，表明受损的 DNA 确实贡献了炎性小体的激活（图4 C）。
💠 根据以上结果，作者总结出：肝细胞线粒体损伤→mtDNA释放→巨噬细胞NLRP3炎症小体激活→加重肝损伤与MDBs形成这一完整调控关系链（图4 D）。
● 文章题目：TGF-β/JNK axis mediates mitochondrial damage and macrophage cGAS-STING
activation in liver Mallory-Denk body pathogenesis[2]
在第一篇文献中，研究团队重点阐明了损伤肝细胞释放的mtDNA 如何作为危险信号，激活巨噬细胞的NLRP3炎性小体，并发现了具有潜在保护特性的脂质相关巨噬细胞（LAM）。第二篇文献则着眼于具体的通路机制探索，重点是寻找肝细胞内的蛋白质错配折叠（MDBs 形成）的启动机制以及mtDNA的逃逸机制。
细胞通讯发现巨噬细胞释放 TGF-β信号引发病变：
还是使用相同的单细胞数据，这里作者进行了细胞通讯分析，主要发现：
💠 在DDC诱导的MDBs模型中，肝细胞与巨噬细胞的交流异常活跃，其中TGF-β信号轴的富集程度高居榜首 （图5 AB）。
💠 临床多组学交叉印证：对临床MASLD患者数据的WGCNA网络分析同样证实（turquoise模块），蛋白质错配折叠、自噬和氧化磷酸化通路在发病中起到了决定性作用 （图5 CD）。
发现巨噬细胞和肝细胞之间的TGF-β信号强度的异常上调，研究团队开始寻找出现变化的上游调控关系，结合转录因子等分析，团队发现：
💠 GSVA分析发现DDC组的TGF-β信号通路、JNK相关的MAPK 通路均显著上调。转录因子分析发现c-JUN表达上调，且主要富集在肝细胞亚群(图6 AB)。WB实验验证了TGF-β刺激可时间依赖性诱导JNK磷酸化与c-JUN激活，该效应早于MDBs标志性蛋白的升高（图6 C）。
💠 双荧光素酶报告实验证实，c-JUN可直接结合UbD 基因启动子，转录激活UbD表达；UbD是MDBs形成的核心分子，与K8、p62共定位构成蛋白聚集体（图6 D）。
肝细胞的mtDNA逃逸是巨噬细胞识别受损肝细胞的关键机制，这一部分研究团队主要关注mtDNA是如何离开细胞的，通过系列实验，发现：
💠 透射电镜与荧光共定位显示，在MDBs形成期间，肝细胞内的线粒体遭到严重破坏，形成具有外膜特征的线粒体衍生微泡（MDVs）。线粒体外膜标记TOM20与mtDNA共定位显著增强，说明mtDNA伴随外膜片段被包装进入MDVs，实现胞内转运与释放（图7 AB）。
💠 GSVA和qRT-PCR结果都显示凋亡相关基因BAX、BAK在DCC组中上调。分离胞质和线粒体进行WB，发现DDC组线粒体中BAX、BAK的蛋白含量显著增加，说明BAX发生了胞质→线粒体的转位，BAK在线粒体膜上富集活化（图7 C）。
💠 免疫荧光发现BAK与mtDNA共定位增强，提示二者在线粒体膜上形成孔道，介导 mtDNA释放（图7 D）。
MDBs的形成与巨噬细胞的浸润在空间上相关。因此mtDNA逃逸之后可能引发了炎症激活。cGAS能够识别线粒体DNA并激活下游信号通路，进而促进炎症过程。结合荧光共定位、WB、qRT-PCR、靶向验证等实验结果发现：
💠 逃逸到胞外的 mtDNA 被周围的巨噬细胞吞噬后，直接激活了其内部的cGAS-STING信号通路，从而诱导大量炎症因子IL-6的释放 （图8 ABC）。
💠 靶向抑制JNK信号，不仅在体内外显著减少了肝细胞内MDBs的聚集，更稳定了线粒体膜结构，切断了mtDNA的释放，从而一举平息了巨噬细胞引发的炎症风暴（图8 D）。
💠根据以上结果，作者总结出：TGF-β→结合肝细胞表面TGF-βR→激活JNK磷酸化→下游出现两条分支（图9）：
① 核内：c-JUN入核→激活UbD→促进MDBs形成；
② 胞质：BAX/BAK寡聚化→线粒体膜通透→MDVs释放mtDNA→激活巨噬细胞cGAS-STING炎症通路；
● 文章题目：Unraveling the HGF/MET axis in Mallory-Denk body pathogenesis associated with liver fibrosis through single-cell transcriptomics[3]
Signal Transduction Targeted Ther.
在先前2篇文献对Mallory-Denk小体（MDBs）发病机制的理解已经深入到了细胞内的分子级别。然而，慢性的实体脏器损伤绝非仅局限于肝细胞与巨噬细胞两个节点的“二人转”。第二篇论文虽然提及巨噬细胞释放的TGF-β是启动恶性循环的开关，但肝脏内真正的纤维化执行者——肝星状细胞（HSCs）是如何被卷入其中的？正是为了将MDBs的发病机制从“实质-免疫细胞的恶性循环”推向“实质-免疫-基质细胞的纤维化微环境网络”，便有了第三篇。如果说第二篇文章找到了驱动病变的“黄金轴心”，那么第三篇文章则是利用单细胞核测序（snRNA-seq）与3D类器官技术，彻底解构了“肝细胞-巨噬细胞-肝星状细胞”三方对话的纤维化联动网络，并锁定了介导这一重塑的核心驱动引擎——HGF/MET/UbD 轴。
相比起前两篇文章研究团队主要关注肝细胞和巨噬细胞，第三篇文章团队将研究目标范围进行了拓展，从而探究纤维化微环境的重塑机制：
💠 通过对肝细胞亚群再分群并评估其分化潜力，研究者发现了一群高表达MDBs特异基因K8/UbD/p62的MDB相关肝细胞（MAHs，即Hep4/Hep5亚群），通过组间的细胞频率差异和GSEA分析，发现活化肝星状细胞（aHSCs）可能是纤维化的主要执行者（图10 ABCD）。
💠 临床多组学交叉印证：通过对临床肝癌（TCGA-LIHC 队列）进行反卷积分析（Deconvolution）与预后评估，证实Hep4/Hep5（MAHs）亚群比例较高的患者临床预后显著更差，明确了该多细胞网络的临床转化价值（图10 E）。
探究细胞微环境，细胞通讯是最常见的分析方法，在上一步重新注释出了一批与疾病相关的关键细胞亚群之后，通过细胞通讯，可以寻找到不同组之间出现明显差异的关键信号通路：
💠 CellChat分析发现，在DDC组中，MAHs、aHSCs 与巨噬细胞（KCs）三者交流紧密。其中HGF/MET信号轴富集程度高居榜首（图11 AB）。GSVA分析发现MAHs（Hep4/Hep5亚群）中HGF下游的PI3K/AKT、NF-κB 通路显著激活（图11 C）。
💠 通过WB等系列实验发现，外源性HGF与MET结合后，通过蛋白磷酸化强烈激活了下游的PI3K/AKT、NF-κB（图11 D）。
💠 结合SCENIC 转录因子网络分析与启动子结合位点预测，团队发现被激活的转录因子 NF-κB1（p50）和STAT3能直接结合并转录激活MDB形成的绝对核心基因——UbD（的启动子，从转录源头驱动了MDB蛋白聚集体的形成（图11 E）。
为了在体外逼真模拟实质-免疫-基质细胞的动态互馈，研究团队首次利用DDC小鼠肝脏成功构建并传代了3D MDB类器官体外模型，该模型完美保留了K8、UbD和p62高表达的MDB病理表型（图12 A）。通过类器官共培养与细胞因子检测发现：
💠 直接共培养与Transwell间接共培养体系对比，证实MDB类器官可通过可溶性旁分泌因子，诱导JS-1肝星状细胞分泌TGFβ1、Mmp14 的能力显著增强，介导肝星状细胞活化（图12 B）。
💠 将MET抑制剂处理后的MDB肝细胞条件培养基作用于肝星状细胞，仍可检测到TGFβ1、α-SMA、Col1a1的分泌升高，进一步佐证MDB肝细胞可分泌促纤维化因子，驱动肝星状细胞活化与纤维化进展（图12 C）。
为了确立该多细胞网络作为临床治疗靶点的可行性，研究团队在体内对核心限速步骤进行了敲除表型实验：
💠 通过CRISPR/Cas9技术构建UbD基因敲除小鼠模型。在DDC诱导下，敲除小鼠肝细胞内的MDB核心成分（K8、p62）蛋白与mRNA 表达剧烈下降，同时抑制了HGF/MET轴的活化，导致血清与组织中的HGF及 TNF-α 炎症因子释放大幅减少（图13 ABC）。
💠 通过H&E染色、Masson天狼星红染色以及免疫组化发现，相比于野生型，敲除小鼠在DDC或DDC+CCl4协同造模下，血管周围的脂肪滴沉积、MDB 聚集以及胶原纤维沉积（纤维化面积）均显著消退和拯救（图13 D），确立了阻断该轴线在临床抗炎症、抗纤维化治疗中的巨大潜力。
💠 根据以上结果，作者总结出：KCs、aHSCs释放HGF→结合肝细胞表面c-Met受体→受体磷酸化→下游出现两分支（图14）：
分支1：STAT3通路激活，促使 Stat3 发生磷酸化。
分支2：PI3K/AKT 通路激活通过 PI3K $\rightarrow$ AKT（磷酸化），进一步导致 IκBα磷酸化，并释放出NFκ 复合物（p50/p65）。
最终影响：磷酸化的Stat3和转录因子p50分别移位进入细胞核结合DNA，驱动炎症依赖性基因的转录。该转录过程直接导致了UbD的高表达，进而促成了MDB的形成。伴随 MDB 形成，受损的肝细胞出现病理重塑，最终直接引发肝纤维化。
第一篇：揭示了“响应现象”，损伤释放的危险信号（mtDNA）吸引了巨噬细胞并激活了NLRP3。
第二篇：锁定了“细胞内物理通路”：明确了巨噬细胞 TGF-β触发肝细胞内JNK/c-JUN级联，并通过BAX/BAK线粒体孔道打包释放mtDNA。
第三篇：进化到了“微环境多细胞微区网络”，引入了肝星状细胞（HSCs）。它阐明了HSCs与KCs共同发射的HGF信号，如何通过MET靶向病变肝细胞，激活NF-κB 和STAT3通路形成UbD，并最终通过HGF/MET/UbD与TGF-β1/Mmp14的双重多细胞正反馈环路，导致肝脏纤维化。
纵观这三篇高分论文的演进，其数据分析手段展现了清晰的“从局部到全景、从体外到时空”的现代化多组学分析范式。很多时候，我们的课题卡在“A细胞刺激B细胞”的固有思维里。第三篇文章引入了第三种基质细胞（HSCs）从而实现了调控关系的闭环。这启示我们，未来的微环境研究不能孤立地看实质或免疫细胞，必须引入空间微区、多细胞联动的概念，才能看清疾病或恶性进展的全貌。
[1]Fang Z., Zhong B., Shi Y., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals characteristic feature of macrophage reprogramming in liver Mallory-Denk bodies pathogenesis [J]. J Transl Med, 2025, 23(1): 77.
[2]Shi Y., Huang M., Zhou W., et al. TGF-beta/JNK axis mediates mitochondrial damage and macrophage cGAS-STING activation in liver Mallory-Denk body pathogenesis [J]. J Transl Med, 2025, 23(1): 621.
[3]Tang X., Shi Y., Pan J., et al. Unraveling the HGF/MET axis in Mallory-Denk body pathogenesis associated with liver fibrosis through single-cell transcriptomics [J]. Signal Transduct Target Ther, 2026, 11(1).
奥智团队始终坚守 “让每一分科研投入都物超所值” 的核心服务理念，针对不同领域、不同阶段的科研探索，奥智生物提供完善的定制化组学科研服务体系，涵盖单细胞组学、空间组学、转录组学、微生物组学、蛋白代谢组学等研究方向。欢迎有项目意向的老师联系我们，奥智生物将为您提供深度定制化的解决方案。
*未经许可，不得以任何方式复制或抄袭本篇文章之部分或全部内容。版权所有，侵权必究。
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
