这份 protocol 的目标，是教你合成 gelatin methacryloyl，也就是 GelMA。
你会把普通明胶改造成一种可以被紫外光或可见光交联的水凝胶前体，
这个产物后续可以用于细胞三维培养、组织工程支架、微凝胶制备、药物递送和可注射水凝胶实验。
Gelatin 是胶原蛋白部分水解后的产物，保留了较多细胞黏附相关结构。
Methacrylic anhydride 会和 gelatin 分子上的氨基、羟基等反应，把甲基丙烯酰基接到 gelatin 上。
接枝后的 GelMA 遇到光引发剂和光照时，可以通过自由基聚合形成三维网络。
你可能会好奇，为什么要费这一圈功夫。普通 gelatin 受温度影响明显，37°C 下容易失去凝胶结构；GelMA 多了可聚合双键，就能通过光交联固定成更稳定的水凝胶。
我做这类材料时最看重两件事，反应要均匀，杂质要洗干净。前者决定批次稳定性，后者决定细胞能不能活得舒服。
这套方法采用 10% w/v gelatin 溶液，在 50°C 条件下进行甲基丙烯酰化反应。温度太低，gelatin 溶解不充分，体系像一锅粘稠的汤；温度太高，蛋白链和活性基团可能被不必要地破坏。
Methacrylic anhydride 需要滴加，猛倒进去会造成局部高浓度，反应不均匀，后面批次差异会很刺眼。
透析是这套 protocol 的清洗环节，它负责去掉未反应单体、小分子副产物和盐。慢，是它的价值。
| 类别 | 名称 | 规格或建议 | 用途 |
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咱们用一个 50 mL 水相体系作为教学版本，这个规模足够训练操作。
| 组分 | 用量 | 终浓度或作用 |
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预热水浴或恒温磁力搅拌器至 50°C。
检查搅拌子、烧杯、移液器、透析袋、冻干瓶和标签。
把 methacrylic anhydride 放在通风橱内备用。
⚠️ Warning!
Methacrylic anhydride 具有刺激性和腐蚀性，并且遇水会反应。
全程在通风橱内操作，佩戴护目镜和丁腈手套。手套污染后立刻更换。
称取 5 g Type B bovine-skin gelatin，加入 50 mL 去离子水。
放入 50°C 条件下搅拌，直到溶液变成均一、透明或微乳白的黏稠液体。
避免剧烈搅拌。泡沫一多，后续滴加和取样都会变得难看。
📝 判断标准
合格的 gelatin 溶液不应该有明显颗粒、絮状物或未溶胶块。
如果烧杯壁上挂着半透明胶块，别急着加反应试剂。继续保温搅拌。
缓慢滴加 2.5 mL methacrylic anhydride 到 50°C 的 gelatin 溶液中，
维持持续搅拌。控制滴加时间在 5–10 min，别一口气推完。
插太深容易挂液，也容易造成局部高浓度反应。
💡 【重要提示】
这决定 GelMA 的取代度，也会影响后续凝胶强度、孔结构和细胞行为。
改变 methacrylic anhydride 用量或滴加速度时，还会改变材料的生物学表现。
继续在 50°C 下反应 3 h，保持搅拌稳定。
观察溶液状态，合格体系应保持均一，无明显沉淀和大片凝聚物。
📝 经验判断
反应过程中溶液可能轻微起泡或浑浊。
大片絮凝、底部沉积、黏在搅拌子上的胶块，都提示局部反应或溶解状态出了问题。
把反应液转移到预处理好的透析袋中，使用 12–14 kDa cutoff 透析袋。
把透析袋浸入大量去离子水中，在 30°C 条件下透析 5 天。
⚠️ Warning!
透析袋不要装太满，留出空间给溶液流动和膨胀。封口不严会让样品漏进水桶。
💡 方法论提示
透析直接影响细胞毒性和后续凝胶表现，残留 methacrylic anhydride 或小分子副产物会让细胞状态变差。
收集透析后的 GelMA 溶液，分装到冻干瓶或冻干盘中。放入 −80°C 冰箱预冻，直到样品完全冻结。
📝 经验判断
冻干前的样品最好冻成完整的白色或半透明固体，半冻半流动的样品进冻干机，很容易喷瓶或塌陷。
冻干样品 3 天，取出冻干后的 GelMA 泡沫状固体。把产物密封，避光，置于 −20°C 保存。
💡 成功产物长什么样
理想的冻干 GelMA 像轻质海绵，呈白色或微黄色，多孔，质地轻。
控制温度，Gelatin 在低温下会变黏甚至凝胶化，反应体系会变得不均一。50°C 是这个流程里很实用的工作温度。
控制滴加，Methacrylic anhydride 的加入方式会影响局部反应。滴加太快，容易形成局部高取代区域。
认真透析，透析时间和换水频率会影响残留小分子。后续要做细胞实验时，这一步不能偷懒。
冻干要彻底，残水会影响称量、溶解、保存和批次稳定性。
记录产物外观，称量冻干后 GelMA 的质量。计算回收率，并与历史批次比较。
📝 预期结果
产物应呈白色至淡黄色多孔泡沫状固体。
气味不应强烈刺鼻，若仍有明显刺激性气味，优先怀疑小分子残留或干燥不足。
取少量冻干 GelMA，加入 PBS 或去离子水。在 37–50°C 条件下溶解。
观察溶解速度、是否有不溶物、是否出现明显浑浊或颗粒。
💡 读数逻辑
溶解性是质量控制指标，如果 GelMA 重新溶解困难，后续配胶、混细胞、微流控制备微球都会变得别扭。
使用 1H NMR 或 TNBS assay 评估甲基丙烯酰化程度。
使用 FTIR 观察酰胺峰和甲基丙烯酰相关信号变化。
使用流变测试评价光交联后水凝胶的储能模量 G′ 和损耗模量 G″。
📝 推荐质控组合
NMR 或 TNBS 负责回答取代度。
FTIR 负责回答化学结构是否出现预期变化。
流变负责回答材料形成凝胶后是否具备目标力学性能。
样品反应时出现絮凝。优先检查 gelatin 是否完全溶解，methacrylic anhydride 是否滴加过快，搅拌是否形成局部死角。
冻干后产物发黏。优先延长冻干时间，降低单瓶装液量，确认预冻是否完全。
细胞实验中毒性偏高。优先怀疑透析不足、残留小分子、光引发剂浓度过高或灭菌方式不合适。
水凝胶交联后太软。检查 GelMA 浓度、取代度、光引发剂浓度、光照时间和光源强度。
水凝胶交联后太硬。降低 GelMA 浓度或调整取代度。力学性能不是越高越好，尤其用于细胞培养时，细胞会用形态和命运给你反馈。