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作者：
摘要：
本文通过对作为动物试验的口腔黏膜刺激性试验以及作为替代方法的琼脂扩散法试验、鸡胚尿囊膜试验、体外3D口腔上皮模型刺激性试验（ET50方法）进行介绍、讨论、分析，结合口腔黏膜的生理特点以及各项试验的技术特点，设计了一套管理、预测流程。希望可以为企业对产品口腔黏膜刺激性的管理和预测提供借鉴，助力我国牙膏、口腔产品产业的规范发展。
关键字：口腔黏膜刺激性、替代方法、NAMs、流程
Discussion on Methods of Oral Mucosal Irritation Testing Methods and Management Strategies for Safety Evaluation of Oral Products
Haoyang Yu1, Lanlan Cai2, E Zhao2, Minghua Ji3
1 AMOREPACIFIC (Shanghai) R&I Center Co., Ltd.
2 Shanghai Cellex Biotechnology Co., Ltd.
3 Director of Regulatory Department, Cosmetics Advancement Committee of China Health Care Association (CACHCA)
Corresponding author: Minghua Ji, CACHCA Director of the Regulatory Department, info@cachca.org.cn
Abstract:
This paper systematically introduces, discusses, and evaluates the oral mucosal irritation test conducted as an animal experiment, along with alternative methods such as the agar diffusion test, HET-CAM, and the 3D oral epithelial model (EpiOralTM) irritation test (ET50 method). By integrating the physiological characteristics of the oral mucosa with the technical specifications of each testing approach, a comprehensive framework for assessment and prediction has been developed. This framework is expected to serve as a valuable reference for industry stakeholders in managing and predicting the irritancy potential of products on oral mucosa, thereby supporting the standardized development of China's toothpaste and oral care product sectors.
Keywords: oral mucosal irritation, alternative methods, NAMs, framework
1.引言
口腔护理产品，包括牙膏、漱口水、口气清新喷雾等产品类型，属于生活必需品，而牙膏作为其中最主要的品类，因市场需求大、使用频率高，需对其实施较为严格的管理，以切实保障产品质量安全。2020年6月16日，国务院发布《化妆品监督管理条例》，规定牙膏参照有关普通化妆品的规定进行管理[1]。2023年12月1日，由国家市场监督管理总局发布的《牙膏监督管理办法》正式生效，其配套的规范性文件《牙膏备案资料管理规定》强制要求儿童牙膏、功效牙膏以及使用尚在安全监测中新原料的牙膏，在备案时提交口腔黏膜刺激性试验报告[2，3]。
《牙膏备案资料管理规定》还明确要求毒理学试验应优先选择《化妆品安全技术规范》或口腔医疗器械的试验方法[4]。而对于口腔黏膜刺激性，仅有YY/T 0127.13-2018 口腔医疗器械生物学评价第13部分：口腔黏膜刺激性试验一项方法 [5]。该方法是使用金黄色地鼠的动物实验；虽然金黄色地鼠颊囊的黏膜类似人类口腔黏膜，但是与目前毒理学的3Rs、高通量理念相违背。同时，由于各国家、地区对牙膏的分类不尽相同，例如欧盟则将牙膏列为化妆品进行管理，因此牙膏产品在欧盟法规体系下受化妆品动物试验禁令限制。众多国际企业或有产品出海需求的国内企业，均谋求使用动物替代方法对产品的口腔黏膜刺激性进行测试。因此本文梳理了目前国内外现有方法中，对口腔黏膜刺激性终点风险评估具有指导意义的方法及其优缺点，并构建了一套管理、预测流程，供监管部门、行业协会和企业借鉴。
2.粘膜组织结构特点
口腔黏膜是牙膏使用过程中最大的接触组织，其不同于普通黏膜，为适应口腔特殊的功能，进化出了兼具正常皮肤组织和黏膜组织的结构特点（表1）。例如，由于口腔硬组织的存在，硬腭与牙龈黏膜明显角化来抵御外物摩擦；唇颊、口底区域存在轻微角化过渡区来兼顾抗干燥、抵御硬组织摩擦的需求；舌背部黏膜的两种乳头结构分别进化角化或无角化特征，兼具食物咀嚼和味觉功能。口腔黏膜上皮以多层扁平鳞状上皮为主，相较于肠道、呼吸道黏膜的单层柱状、纤毛柱状上皮更贴近正常皮肤上皮结构；但又与角膜、虹膜的非角化复层鳞状结构有明显差异。此外，口腔颊粘膜和牙龈黏膜细胞的更新周期分别约为25天、50天左右，不同于其他典型黏膜组织的1周左右更新周期（角膜的修复更新速度更快）；与正常皮肤细胞的28天左右更新周期更为相似。
类型
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牙龈粘膜
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口腔黏膜
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颊黏膜（咬合线）
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舌背黏膜
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角膜、虹膜
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上皮结构
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复层鳞状
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复层鳞状
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复层鳞状
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菌状乳头；
丝状乳头；
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复层鳞状
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角化状态
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明显角化
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未角化
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轻微角化
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未角化及角化同时存在
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未角化
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腺体类型
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/
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唾液腺
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唾液腺
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唾液腺
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/
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神经系统
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末梢密集
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末梢密集
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末梢密集
|
末梢密集
|
末梢密集
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血管分布
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浅
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浅
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浅
|
浅
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深（角膜无血管，但虹膜血管丰富）
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表1 口腔黏膜和典型黏膜间结构特点的对比
由于口腔黏膜兼具正常皮肤和黏膜的结构特点，导致其无角化部分易受损伤、神经末梢密集受刺激后疼痛感强烈、血管深度浅更容易受刺激后出血、非角化区域受长期刺激后鳞状癌高发。因此，对于长期、持续使用的牙膏进行口腔黏膜刺激性的测试有其必要性。但是因为其与典型黏膜的单层、假复层结构（肠黏膜）以及无角化的角膜、虹膜相比，其部分角化的复层鳞状结构对刺激物的耐受性要相对更强；因此在制定测试方法和策略时，也应考虑这个问题。
3.方法整理及分析
目前已开发方法中，除基于体外3D重建口腔上皮模型开发的方法外，无专门针对口腔黏膜作为靶器官进行测试的毒理学替代方法或NAMs。因此，考虑到口腔黏膜从组织结构上相较于普通黏膜组织对刺激的耐受度更强的特点，对使用其他黏膜组织进行测试的替代方法对口腔黏膜刺激性终点是否具有指导意义进行探讨。
序号
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方法名
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代表标准名
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备注
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1
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口腔黏膜刺激性试验
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YY/T 0127.13-2018 [5]
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2
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琼脂扩散及滤膜扩散试验
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YY/T 0127.9-2009 [6]
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参考自ISO 7405:2008 [7]*
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ISO 10993-5:2009(E) [8]
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3
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鸡胚尿囊膜方法
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SN/T 2329-2009 [9]
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DB-ALM N96o [10]
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COLIPA [11]
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仅存论文
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4
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基于EpiOral口腔上皮模型ET50方法
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MatTek公司推荐的检测操作规范 [12]
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表2 粘膜刺激性试验方法
* ISO 7405:2008目前已经被ISO 7405:2025替代。
3.1 YY/T 0127.13 口腔黏膜刺激性试验
该方法使用金黄色地鼠，根据受试物的实际暴露情况有长期接触法和急性接触法两个细分方法。长期接触法又分为缝合接触和项圈法两个方案；急性接触法也分为一次接触法和多次接触法两个方案。牙膏产品属于长期使用、单日多次急性接触的产品，故而一般采用急性接触法中的多次接触方案。通常情况下，在试验地鼠的颊囊处放置牙膏产品5分钟，每1小时重复一次产品接触，每次接触后和重新放置产品前检查颊囊；重复4次，在末次接触后的24小时内肉眼观察颊囊的刺激情况，并按要求处死动物后，去颊囊黏膜及周围组织石蜡包埋、切片、进行H&E染色完成组织病理学检查。
项目
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反应
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计分
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上皮
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正常、完好无损
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0
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细胞变性或变扁平
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1
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组织变形
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2
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局部糜烂
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3
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广泛糜烂
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4
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白细胞浸润（每个高倍镜视野数）
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无
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0
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极少（≤25）
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1
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轻度（26~50）
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2
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中度（51~100）
|
3
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重度（＞100）
|
4
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|
血管充血
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无
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0
|
极少
|
1
|
|
轻度
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2
|
|
中度
|
3
|
|
重度伴血管破裂
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4
|
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水肿
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无
|
0
|
极少
|
1
|
|
轻度
|
2
|
|
中度
|
3
|
|
重度
|
4
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表3 组织病理学检查评分
根据实验中肉眼观察颊囊的红斑和焦痂形成情况并记录；以及组织病理学检查对上皮、白细胞浸润、血管充血、水肿的具体情况给予对应评分（表3）。根据组织病理学检查的评分总和并除于实验动物数算出各自的平均指数。最终以实验组平均刺激性指数减去对照组平均刺激指数，算出刺激指数；并根据刺激反应分级（表4），对测试物质的口腔黏膜刺激性进行分级。
刺激指数
|
反应程度
|
法规接受程度
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0
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无刺激性
|
可接受
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1~4
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极轻度刺激性
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可接受
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5~8
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轻度刺激性
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/
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9~11
|
中度刺激性
|
不接受
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12~16
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重度刺激性
|
不接受
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表4 口腔黏膜刺激性试验刺激指数评判标准及法规接受性
目前，普遍认为刺激性分级为无刺激性、极轻度刺激性的为可接受结果；而轻度刺激性可能需要更多证据进行说明，例如：结合临床测试，或者功效测试中的不良反应情况进行判定。
该试验目前为我国牙膏产品必检试验项目，可作为替代方法开发、验证的金标准。
3.2 琼脂扩散及滤膜扩散试验（YY/T 0127.9-2009、ISO 10993-5:2009(E)）
该方法实际上是口腔医疗器械生物学评价中细胞毒性进行测试的方法。方法选用ATCC CCL1（NCTC clone 929）细胞株，将处于对数生长期的细胞配置成2.5×105个/mL的浓度并接种于培养皿（或6孔板），在37±2℃，5% CO2饱和湿度条件下孵育24小时。将3%琼脂或琼脂糖胶体灭菌后置于恒温48℃水浴环境中，防止其凝结。将2×生长培养基预热至48℃，按1:1的比例和恒温琼脂或琼脂糖进行混合配置得到用于试验的琼脂或琼脂糖培养基，继续置于48℃恒温水浴防止凝结。将培养板（或6孔板）中的培养基吸出，注入10mL配置好的琼脂或琼脂糖培养基，放置30分钟以便琼脂或琼脂糖培养基凝结。然后再加入10mL提前配置好的中性红活体染色液（1%水溶性中性红染液与 Dulbecco’s磷酸盐缓冲按照1:100比例配制），避光孵育15~20分钟后，移除多余的中性红溶液。将试验样品（固体原样、浸提液或吸收有0.01mL液体样品的5mm圆形超细硼硅玻璃纤维滤纸）放置于凝胶表面适当位置，在37±2℃，5% CO2饱和湿度条件下继续孵育24小时。每个测试样品需要最少4个重复，如果样品为浸提样品，则还应该设置浸提液对照组，如果使用培养皿进行试验，每个培养皿最多操作2个试验样品，并远离皿壁。孵育结束后，利用具有显微标尺的倒置显微镜（或具有数显功能的高精度游标卡尺）观察周围褪色区域，并按一下标准对褪色指数和溶解指数进行评分。（各个标准或论文中的评估标准有一定差异，但是试验指标确定为褪色区域边缘和贴片边缘的距离或平均距离。）
指数
|
褪色指数
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溶解指数
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0
|
样品周围和下方均未褪色
|
未发现细胞溶解
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1
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仅有样品下方褪色
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小于褪色区面积20%的细胞溶解
|
2
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褪色外缘与样品外缘距离＜0.5cm
|
褪色区面积20~40%的细胞溶解
|
3
|
褪色外缘与试样外缘距离在0.5~1cm范围
|
褪色区面积40~60%的细胞溶解
|
4
|
褪色外缘与试样外缘距离>1cm
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褪色区面积60~80%的细胞溶解
|
5
|
整个培养皿（或孔）褪色
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大于褪色区面积80%的细胞溶解
|
表5 琼脂扩散法褪色、溶解指数判定标准
计算每个测试的褪色指数和溶解指数的中位数，若每个样品4个重复的指数均在0~3之内，且相差2个单位，则试验失败需要重新试验；若有试验浸提液对照组，则应该由试验样品指数减去浸提液对照组指数作为样品的最终结果。然后按照以下标准对细胞毒性进行评估。
分级
|
细胞反应
|
细胞毒性说明
|
0
|
0
|
无细胞毒性
|
1
|
1
|
轻度细胞毒性
|
2
|
2~3
|
中度细胞毒性
|
3
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4~5
|
重度细胞毒性
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表6 琼脂扩散法试验结果判定标准
与其类似的试验还包括滤膜扩散试验，作为琼脂扩散法的补充，特别是用于检测不能通过琼脂扩散物质的检测。
琼脂扩散法因为使用琼脂或琼脂糖制造了可以放置原料、产品的上表面，因此相比于普通的细胞方法，利于检测水溶性较差的原料或产品。虽然该方法从标准制定目的而言是为了测试样品的非特异细胞毒性，但也有研究证明，在对评分标准和判定方法进行优化后，其试验结果对于其他黏膜组织刺激性（主要是角膜）的判定具有一定的预测性。特其中一项研究对16个化妆品内容物（包括3种睫毛膏、3种液体彩妆、2种膏状彩妆、4种清洁产品、1种乳液、1种眼影、1种唇膏、1种爽肤水）同时使用Draize兔眼刺激性试验和琼脂扩散法结果进行了比较 [13]。结果显示，琼脂糖扩散法的结果和刺激性存在了正相关性，预测一致性为81.25%；假阳性率为12.5%；假阴性率为6.25%。另外还有一项研究对更大规模的化妆品（包括了O/W、W/O乳化体系、非乳化乳液、悬浊液、粉末类型的56个内容物）开展Draize兔眼刺激性试验和琼脂扩散法测试，其结果显示琼脂扩散法与Draize兔眼刺激性试验结果具有86%的一致性，灵敏度高达92%；假阳性率为16%，假阴性率为8%，方法可重复性和变异性也在生物学方法的可接受范围之内 [14]。由于琼脂扩散法方法的高灵敏度和眼刺激性的高相关性，研究人员尝试将其用于牙膏对口腔黏膜刺激性的预测，有研究发现琼脂扩散法对牙膏中可能导致刺激的表面活性剂以及牙膏产品进行了研究，发现25%浓度稀释后的预测结果对牙膏产品的刺激性分离度比较好，进而认为可以以25%的浓度利用琼脂扩散法对牙膏产品的口腔黏膜刺激性进行评估 [15]。以上几项已有研究结果高度一致，表明相较于传统的Draize试验，琼脂扩散法可能更为灵敏。考虑其对相较于口腔黏膜更为敏感的眼刺激性具有较好预测效果的特点，认为其预测结果在产口腔品开发早期的筛选上具有应用意义。
3.3 鸡胚尿囊膜方法
尿囊膜上有非常丰富的血管，与黏膜的高度血管化结构相似，但是没有固有层机构、缺乏杯状细胞/免疫细胞的支持。因此HET-CAM、CAMVA试验均是评估尿囊膜在受刺激后血管反应的时间或程度，进而根据评估标准对受试物的黏膜刺激性进行分类评估。其中HET-CAM比较适合测试无刺激至中度刺激的受试样品、CAMVA适合测试轻刺激到中度刺激的受试样品。目前常用HET-CAM方法，其是利用孵化至9~10日龄的SPF种蛋打开气室并移除外膜后在受精卵的尿囊膜上进行试验。将受试样品或稀释样品放置于尿囊膜表面。对于透明、或不影响观察的样品采用计时法，测定出现5分钟内尿囊膜出现出血、溶血、凝血现象的时间；根据反应时间计算IS值或按照特定的公式结合刺激性标定物质（5% Texpon ASV）的刺激指数计算Q值。对于固体、有颜色或其他影响对尿囊膜反应观察的样品则采用终点法进行测试。根据各个类型的反应时间、刺激评分，按照各标准下的评判标准，对样品的刺激性进行预测评估。目前，各个标准下HET-CAM的具体试验方法略有差异（表7）。
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SN/T 2329-2009
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DB-ALM N96o
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COLIPA
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SPF种蛋孵育时间
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9
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10
|
10
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每个样品所需种蛋
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6
|
6
|
6
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加样量
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0.3g或0.3mL
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0.3g或0.3mL
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0.3g或0.3mL
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计时法指标
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IS
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IS/Q
|
IS/Q
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终点法暴露时间
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3分钟
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3分钟
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30秒
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终点法评估指标
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刺激性评分
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刺激性评分
|
刺激性评分
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终点法复测阈值
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某项指标总分≥12
|
某项指标总分≥12
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结果存疑
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复测内容
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终点法复测1次；最高溶解度透明溶液计时法复测一次（最终结果以终点法复测为准）
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30秒暴露，终点法复测1次
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最高溶解度透明溶液计时法复测（最终以评判结果最严重者为准）
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表7 HET-CAM常用方法的差异对比
与琼脂扩散法相似，HET-CAM主要用于对化妆品成分、原料、产品的眼刺激性进行预测，由于其高度的敏感性，很多学者用该方法预测了牙科用固化剂、垫片等医疗器械对口腔黏膜的刺激性。Dahl JE对36种牙科粘接剂进行了预测，结果显示其中的33种粘结剂均表现为中度以上刺激性，刺激性结果不受溶剂影响。Dahl JE等又对1种义齿产品、11种义齿垫层、1个涂层材料、2个粘接剂利用琼脂扩散法、HET-CAM方法同时进行了预测，结果显示在同时满足2个方法条件的11个受试样品中，6个样品的结果完全一致，3个样品的结果相似，结果完全相反的样品仅1个 [16]。而粘接剂的结果与此后另一项对36种牙科粘接剂刺激性预测研究的结果相似，该研究发现33种粘结剂均表现为中度以上刺激性，且刺激性结果不受溶剂影响 [17]。这些结果与更早之前的另一份对34种牙科粘接剂的HET-CAM预测研究结果也基本一致，该研发发现34中牙科粘接剂中，仅有3种粘接剂被预测为无刺激性，其余31种粘接剂均预测为不同程度刺激性；而且即便组成成分类似的粘接剂也表现出不太相同的刺激性，这可能与其具体含量相关。除以上早期研究之外，近年来也有研究利用HET-CAM方法对新型的牙科粘接剂的生物相容性开展了研究，发现自2011年以后陆续开发出的通用型牙科粘接剂较此前的牙科粘接剂在尿囊膜上表现出的刺激性有了较大改善，研究所测试的牙科粘接剂无论是聚合后的状态，还是聚合反应过程中均未表现出明显的刺激性[18]。同时还有包括对槲皮素、牙科用羟基磷灰石复合材料的安全评估中均使用HET-CAM对其黏膜刺激性开展了预测评估，特别是牙科用羟基磷灰石的研究中还使用该结果基于证据权重（WoE）进行了全面的安全评估 [19，22]。
HET-CAM对测试物没有水溶性的要求，而且膜表面作为可接触原料或产品的面，决定了HET-CAM方法可检测原料以及产品。但是HET-CAM作为一个半主观的实验方法，对实验人员的要求较高，不同实验人员可能造成评分误差，因此需要持续对实验人员进行均一性培训，将实验人员的评估标准统一化。目前有研究尝试利用AI图像识别技术来替代实验人员对尿囊膜表面的血管变化进行评估，以求获得更为精准和统一的评分，使实验结果更为定量、客观。但是目前学界普遍认为HET-CAM过于敏感从而导致其假阳性率偏高，是其方法学上的重要缺点。
对于HET-CAM方法，欧盟在2009年对化学物的危害识别法规中，认为其可作为严重眼刺激化学物的预测替代方法。基于其高度的灵敏性，可与琼脂扩散法形成组合策略在牙膏原料管理和成品配方预测、筛选方面发挥作用。
3.4 体外3D口腔上皮模型刺激性试验（ET50方法）
EpiOralTM是MatTek公司基于体外3D重建技术，采用原代人口腔黏膜上皮细胞，运用组织工程技术，研发和构建的具有与人口腔黏膜上皮结构高度相似的3D口腔上皮模型（图1）。该模型具有与人体口腔黏膜高度相似的完整组织结构，并且建立了完善质量控制标准（阳性对照1% Triton X-100：34.8分钟 < ET-50 < 105.8分钟，阴性对照：OD > 1.0）。统计近来九年的合格质控数据（每年20-30批次）表明，EpiOral模型的质量非常稳定 [20]。待测口腔产品和原料可以涂抹于该模型的上表面，高度模拟日常的使用场景，因此适用于各种口腔产品原料和成品的口腔黏膜刺激性评估。EpiOral口腔上皮模型口腔刺激性测试方法的研发和应用已有近20年的历史实例，被国外口腔产品的头部公司所采纳 [21]。另外，EpiOral口腔上皮模型也已经广泛应用于OTC药物和医疗器械的口腔刺激性测试 [20]。目前EpiOralTM模型在国内已经通过上海西指生物成功国产化，是目前国内可以直接购买到的唯一成熟商业化3D重建口腔上皮模型。
EpiOralTM
|
人体口腔黏膜
|
|
|
图1 体外3D重建口腔上皮模型和人口腔黏膜的组织结构对比
EpiOralTM模型从上海生产基地运出，由专业生物冷链公司送达用户后，需要首先将专用的培养基预热到37℃，然后在实验前1个小时，将低温保存的模型组织从琼脂糖模具中取出，仔细去除模型周围残留的琼脂糖后放置在已经添加0.9mL 37℃培养基的6孔板中，在37℃，5%CO2条件下预平衡1个小时。样品建议使用灭菌超纯水1:1稀释后制成受试物备用。在6孔板的另2个孔内提前加注0.9mL预热好的培养基，然后将40μL受试物加注到达到平衡状态的模型表面，充分和模型接触。将加样后的模型移入加注有新鲜培养基的孔内，保证模型同培养基充分接触。将模型重新置于37℃，5%CO2条件下，且根据受试物的实际刺激性程度，采取20、60、120分钟的暴露条件或对于更温和的产品采取更长的暴露时间（如：1、4、18小时）进行测试。在首个暴露时间结束前的1小时，按照要求配置含有1mg/mL浓度MTT的DMEM（无酚红）培养基（配置好的含MTT培养基在2-8℃保存不能超过24小时）。在每次暴露结束前15分钟，将300μL的MTT培养基加注到不透光材质的24孔板（或进行避光处理），并做好标记。当达到暴露时间后，逐个取出模型，倒出残留的受试物，冲洗模型（~400 μL PBS, 冲洗3次），冲洗时避免损伤模型。清洗完成后，从内到外清理模型上的液体残留，然后将模型转移到准备好的加注了MTT培养基的24孔板，保证模型和MTT培养基充分接触。37℃，5%CO2条件下避光孵育3小时。结束孵育后，用灭菌棉棒清洁模型底部和外部，去除残留、挂壁的MTT培养基。然后将模型完全浸没在加注了2mL提取液的24孔板之中，避光条件静置过夜提取；对于有颜色的或者未能完全从模型表面清洗干净的样品，可以将模型转移到加注1ml提取液的24孔板使得MTT从模型小室的底部提取，提取结束后，再补1ml提取液至总提取液为2ml。提取结束后，混匀提取液，吸取200μL至96孔板，以提取液作为空白对照，在570nm处测量吸光度。按照公式计算细胞活率，并绘制剂量-反应曲线，推算各样品的ET50值，并且利用公认的基准物质预测各样品的刺激性。
Klausner和Wertz等应用EpiOralTM模型对15种市售口腔护理产品进行刺激性测试，每种市售产品至少进行两批平行实验 [21]。结果表明，EpiOral口腔刺激性ET50方法批间重复性良好，而且可以很好的将市售口腔护理品进行比较归类：ET50（牙膏类）< ET50（口腔清洁类）< ET50（漱口水及婴幼儿牙膏类）。该方法可有效区分产品刺激特性，并为新配方开发提供预测依据。
同时，他们也应用该方法测试比较了几种实验室原型口腔护理产品配方的不同成分对于口腔刺激性的影响，研究发现，随着SLS浓度升高，ET-50值降低，IL-1α与IL-1β释放量增加。添加非离子共聚物poloxomer 407，可缓解SLS的刺激性，表现为显著提升ET-50值并降低细胞因子释放。该结果与体内脱屑试验结果一致，预示着该方法可以有效检测配方中不同成分的刺激性差异。此外，对于温和配方（24小时暴露后活力仍高于50%），细胞因子释放和组织模型的上层细胞组织结构性改变也可能成为温和性评价指标 [21]。
3.5 各替代方法的优缺点分析 实际上，在国外的研究中，常常使用眼刺激性的方法对口腔黏膜刺激性进行预测，包括使用STE（兔眼细胞短时暴露法）、BCOP（牛眼浑浊度试验）、3D重建眼角膜模型（HCE和EpiOcular）方法等。但是考虑STE方法实际上只能检测水溶性较好的成分或原料，缺乏产品的刺激性预测意义。对于BCOP方法，由于试验原材料获取不易，在我国开展实际上有较大困难，同时其灌流设备价格高昂，企业实施困难较大。而利用体外3D重建眼角膜模型开展组织水平的检测，虽然目前在我国能直接购买到商业化的成熟模型，对试验硬件设备要求也较低还能同时兼顾检测原料、产品需求，但是由于目前本文已经采纳了与口腔黏膜组织更为接近的体外3D重建口腔上皮模型方法，而且EpiOral口腔上皮模型方法作为常规的口腔黏膜刺激性的测试手段，因而此综述中未纳入重建角膜模型刺激性测试方法作为口腔刺激性推荐测试方案。
对于以上方法，根据方法特异性、灵敏性、适用性、硬件要求分析其优缺点，为制定科学的原料、产品管理、评估策略提供依据。
方 法 名
|
特 异 性
|
灵 敏 性
|
适 用 性
|
硬 件 要 求
|
操作要求
|
琼脂扩散法
|
良好
|
较高
|
中
|
高*
|
完备的细胞培养理论和试验技能
|
HET-CAM
|
良好
|
较高
|
中
|
中**
|
实验人员间均一的评判水平
|
重建口腔上皮模型方法
|
优秀
|
高
|
高
|
中***
|
标准的实验操作和成熟简单的模型操作方法，更接近于人体口腔粘膜的生理反应
|
表8 各种方法的方法学特点分析
*琼脂扩散法：生物安全柜、完善的细胞培养及冻存体系、带纤维标尺功能的倒置显微镜、灭菌和恒温水浴设备；
**HET-CAM：SPF种蛋孵育器、带LED冷光源的体视显微镜；
***3D重建口腔上皮模型方法：洁净台（或生物安全柜）、CO2培养箱、分光光度计或酶标仪等，培养环境低于细胞培养，可以在非细胞培养的条件下进行。
4.口腔产品的口腔黏膜刺激性评估策略
牙膏或其他口腔清洁产品要达到清洁的目的，其配方中含有较高含量的表面活性剂、起泡剂或其他具有去除口气、抑菌效用成分，因此存在一定的刺激性。但是口腔粘膜由于和正常皮肤存在较大的结构差异，其对刺激的耐受程度低于正常皮肤。因此长期以来，口腔清洁产品或其中的成分都被怀疑是造成包括复发性口腔溃疡等的诱因[23，24]。因此如何开发刺激性更低的产品或者保障产品的刺激性风险在可接受的程度内是广大消费者对产品安全性的普遍诉求，也是政府监管的重点关注方向。目前可以评估口腔黏膜刺激性的动物替代方法比较少，并且由于替代方法均存在一定缺陷和假阴性、假阳性率，通常要使用整合策略进行评估。因此我们按照方法的成熟度和预测结果的可靠性；按照自下而上的评估策略，同时结合企业管理的特点，将口腔产品的黏膜刺激性评估分为研究和申报两个阶段，在研究阶段主要使用成本较低、快速和整合目前很多企业已经构建或有能力构建的琼脂扩散法和鸡胚尿囊膜方法对大量的实验室打样内容物进行口腔黏膜刺激性预测，对经过初步筛选的原料，采用3D重建口腔上皮模型方法进行进一步验证，或者在研发资金允许的条件下直接采用模型进行初筛。在原料管理和低刺激性配方筛选方面，构建了一个评估、管理的策略。对于有严禁动物试验的企业，建议直接采用3D重建口腔上皮模型方法作为口腔刺激性测试主要评估手段。
该策略通过琼脂扩散法和鸡胚尿囊膜方法两种替代方法的联用，降低假阳性率和最大程度克服两个方法固有缺点，并作为前期筛选方法。基于重建口腔上皮模型的组织结构和人口腔黏膜的高度生理反应和组织结构相似性，以及方法学上适当的灵敏度，极高的相关性，将其作为替代仓鼠颊囊口腔粘膜试验体外检测方法，为配方开发和评估最终产品配方提供口腔刺激性的体外替代的安全评估依据。（图2）
图2 牙膏产品口腔黏膜刺激性全流程管理策略
5.结论
口腔产品是现代社会人类生活的必需品，其使用几乎贯穿了人的一生，对维持牙齿、口腔的健康发挥了重要作用。但是其潜在的刺激性也可能是造成一些口腔疾病的原因之一，刺激性对口腔健康造成危害的风险不容忽视。目前我国法规体系下，强制要求进行部分牙膏产品的口腔黏膜刺激性试验来确保产品对消费者的健康危害风险在可接受范围内。这是政府职能机构保护国民健康的具体表现。但是，目前法规体系下仅有动物试验方法，越来越不利于国外优秀产品的进入和我国产品出海的现实需求。为了符合毒理学的主流发展方向，同时便于企业开展配方筛选等研发活动，我们建议尽快开展口腔黏膜刺激性NAMs的研究、转移、验证、采纳工作。此外，协会、企业可推动扩展已有替代方法的应用范围，转移接受已有的优秀试验方案是快速推进牙膏口腔黏膜刺激性的科学预测、规范管理的最佳方法。
我们注意到国外也有学者发表了利用诸如兔眼细胞短时暴露法（STE）、牛眼浑浊度试验（BCOP）甚至重建角膜模型（HCE和EpiOcular）等眼刺激性方法来预测、评估包括牙膏在内的各种口腔产品刺激性的预测方案。但是由于STE方法实际上只能用于测试易溶于水的原料，其在方法的适用性上存在明显缺陷，因此在本探讨中未采纳。BCOP则由于其试验材料（牛眼）的获取较为不便，同时其对样品的粘度有一定要求，而对产品的剂型有一定的限制；此外其试验设备昂贵不利于企业开展，故未作为本次探讨的候选方案。3D重建角膜模型和3D重建口腔黏膜模型虽然都是基于体外组织工程技术的人工培养组织，但是3D重建口腔上皮模型是采用人原代口腔上皮细胞构建的，组织结构与人体口腔黏膜更为相似。EpiOral口腔上皮模型具有长期的口腔刺激性测试的应用历史和实例，被口腔产品的国际头部企业广泛采纳；该模型有完整成熟的质量控制体系与长期稳定的质控记录；该模型已经实现国内生产，奠定了国内应用的技术基础。因此本探讨中仅推荐3D重建口腔上皮模型。企业、研究机构在开发评估策略时也可以根据自身情况和特定环境，选用其他利于开展的方法。同时还应该注意到，文中所介绍的方法，目前并没有形成一个标准化的、完全适用于口腔产品黏膜刺激性的评判标准。因此各企业可通过协会、学会等社会团体，对更多的创新方法、已有方法的组合应用开展更多判定标准、组合应用的创新研究，开发符合我国国情及企业自身情况的优秀方法、策略，并加以推广、应用。
本文介绍了几种已被尝试用于口腔黏膜刺激性预测的替代方法，并基于这些方法设定了一套管理、预测流程。希望可以为企业对产品口腔黏膜刺激性的管理和预测提供借鉴，助力我国牙膏、口腔健康产业的规范发展。
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