PNAS：饶子和院士团队首次揭示介导利福平耐药性的分枝杆菌ABC转运体冷冻电镜结构- 大数跨境

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PNAS：饶子和院士团队首次揭示介导利福平耐药性的分枝杆菌ABC转运体冷冻电镜结构

中科脂典

2024-09-13

导读：揭示了介导利福平耐药性的分枝杆菌ABC转运体的结构基础，为对抗利福平耐药性提供了不同的分子见解。

介导利福平耐药性的分枝杆菌ABC转运体冷冻电镜结构

2024年9月，南开大学、上海科技大学、中科院遗传发育所等相关单位的研究人员在《PNAS》（IF：9.4）发表了题为“Cryo-EM structures of a mycobacterial ABC transporter that mediates rifampicin resistance”的研究论文，揭示了介导利福平耐药性的分枝杆菌ABC转运体的结构基础，为对抗利福平耐药性提供了不同的分子见解。

亮点概述：

Rv1217c-1218c的过表达介导耻垢分枝杆菌（Msm）的利福平耐药。
Rv1217c-1218c在核苷酸结合下发生构象重排。
磷脂分子为Rv1217c-1218c转运体系统的重要组成部分，并参与利福平耐药。

研究背景

耐药结核病（TB）是一个全球性公共卫生问题。利福平是治疗结核病最有效的药物，对其产生耐药性是一个日益严重的问题。Rv1217c-1218c是从临床耐多药结核病（MDR-TB）分离株中鉴定出来的，并被鉴定为是一种ATP结合盒（ABC）家族转运体，可介导包括利福平在内的多种结构无关的药物的耐药性。然而，Rv1217c-1218c如何在分子水平上作为转运体起作用尚未可知。

为了在细菌水平上研究Rv1217c-1218c与利福平耐药性相关的功能，研究人员在耻垢分枝杆菌（Msm）mc² -155菌株中表达了Rv1217c-1218c的编码基因并进行了相关研究，该菌株在体外生长过程中也对利福平敏感。结果表明，Rv1217c-1218c通过ATP水解驱动的转运活性介导Msm对利福平的耐药性。

Rv1217c-1218c的功能表征和整体结构

接下来，研究人员对Rv1217c-1218c的整体结构进行了研究，主要分析了Rv1217c-1218c的跨膜结构域（TMDs）和典型核苷酸结合结构域（NBDs）。研究人员从Msm表达体系中表达纯化出Rv1217c-1218c，发现该转运蛋白结合了内源性脂质包括心磷脂（CL）和磷脂酰乙醇胺（PE），并将其搭建到最终模型中。随后通过功能分析研究了脂质在Rv1217c-1218c活性中的作用。

糖酵素（GDN）纯化的Rv1217-1218c样品组和GDN缓冲液对照组的脂质组学分析

与大多数报道的V型转运体不同，Rv1217c - 1218c的两个TMD结构域在脂质双分子层内几乎没有接触。其中，TMD1的胞质面带更多正电荷，有利于通过其精氨酸簇（包括TM2上的Arg120、TM5上的Arg206和Arg209）与CL的极性头部结合。CL的尾部与内部TMs1/2/5形成广泛的疏水相互作用，使其能够到达跨膜区外侧叶。非底物-脂质结合通常见于在去垢剂胶束或脂质环境中纯化的V型转运体结构中，如人源的ABCG2和ABCA4蛋白中发现了胆固醇，ABCA1、ABCA3和ABCA4中发现了磷脂（PLs），表明这类转运蛋白具有共同的亲脂性结构特征。有趣的是，尽管这两个TMD在没有核苷酸的情况下处于分离的状态，但Rv1217c-1218c的NBD仍然保持二聚状态。RecA样结构域和螺旋结构域都参与了二聚反应。研究人员对NBD进行了分析，推断 Rv1217c-1218c 的非经典特征基序（YSKGN）以及Q环与NBD二聚化有关。二聚体界面的其他相互作用则由RecA样结构域和螺旋结构域之间的氢键和范德华力介导的。在没有ATP的情况下，Rv1217c- 1218c的NBDs也采用了“头对尾 ”构型，这似乎更有利于ATP结合。

无核苷酸状态下TMD和二聚化NBD的结构特征

为了了解ATP驱动的Rv1217c-1218c构象重排的分子基础，研究人员使用了不可水解的ATP类似物腺苷酰亚胺二磷酸（AMPPNP）用于电镜样本的制备，并解析了Rv1217c-1218c在AMPPNP-Mg²⁺结合态下的结构。与无核苷酸状态相比，AMPPNP结合导致NBD二聚体更为闭合。这在很大程度上是由于一个NBD的α螺旋结构域和RecA样结构域向邻近的NBD旋转形成典型的“头对尾”构型。与未结合核苷酸状态下的结构相似，R结构域密度较低，表明R结构域具有很高的柔性。

最后研究人员对AMPPNP结合后TMDs的三层构象变化进行了阐述。基于这些结构变化，研究人员提出在缺乏底物和ATP的情况下，两个EHs结构域（EH1和EH5）作为TMD易位途径的周质门，而两个NBD通过形成四个盐桥而部分二聚化；底物通过未知机制结合到中心腔。ATP结合诱导NBD的完全二聚化和TMD腔的塌缩，而底物的释放是通过周质门的打开来促进的，这证明了EH5具有较高的柔性参与到底物外排反应。在TMD中结合的磷脂被认为通过“侧面进入”的方式进入，并构成Rv1217c-1218c转运体系统的组成部分。