本周分享 | 国产IVD原料正当时——荧光微球

一、前言

荧光微球是指直径在纳米至微米级(0. 01～10 μm)范围内负载有荧光物质，受外界能量刺激能激发出荧光的固体微粒。侧向层析技术（lateral flow assay，LFA）近年来发展迅速，具有简单、快速、不依赖大型仪器设备、价格低廉等优势，被广泛应用于即时检验、现场检验以及家庭自检。

二、荧光微球的制备方法

荧光微球在微球上的负载可分为溶胀吸附法、包埋法、化学键合法和共聚法四种方法，下面将对各对各种方法的优缺点进行介绍。

（1）溶胀吸附法

溶胀法吸附染料的一般过程是，首先将聚苯乙稀微球分散在水或乙醇等体系中，将荧光染料溶解在四氢呋喃或二氯甲烷等能够与微球分散体系互溶、同时又对微球有良好溶胀效果的有机溶剂中，将两分散液混合，染料就会由于溶解度的差异随有机溶剂进入微球内部，并通过物理吸附作用留在微球内，溶剂通过溶胀作用进入微球的过程如下：

图1 溶液溶胀吸附示意图

Fig.1 Dye incorporation process using swelling procedure

（2）包埋法

包埋法中，荧光染料是在聚合阶段即加入到微球体系中，随着微球聚合过程的进行被逐渐被包埋到微球内部。与溶胀吸附法相比，包埋法获得的微球染料包埋深，可有效阻止染料的泄漏。

（3）化学键合法

化学键合法是荧光物质与聚合物发生化学反应，使荧光物质化学键合在聚合物表面之上制得荧光微球。实现微球与荧光物质的对接，荧光物质以“荧光点”的形式分布在聚合物微球的表面，荧光强度与稳定性高于吸附法制备的荧光微球，并可选择性地结合多种荧光物质，示意图如下：

图2 化学键合法制备荧光微球

Fig.2 Preparing fluorescent microsphere by using chemical bonding method

（4）共聚法

共聚法是指带有可聚合官能团的荧光物质与可聚合官能团的有机单体进行聚合，通常采用乳液聚合、悬浮聚合、分散聚合等方法制备，由此可以制得结构均一、性能较为稳定的荧光微球。这种方法制得的荧光微球荧光物质均匀分布，荧光微球的荧光性能也更稳定。

（5）层层自组装法

利用聚电解质以及相反电性量子点之间的静电吸附作用，可以实现聚电解质以及量子点在微球表面的交替结合。调整聚电解质以及量子点结合的层数，可以控制微球表面负载的量子点的数量。

三、侧向层析技术中的常见标志物

随着现实需求的不断增加，侧向层析的标记物也在不断的探索研究中。理想的标记物应该具备性能稳定、制备简单、灵敏度高、重复生产性高、假阳性低等特性，除此之外还应具备制备成本经济的特点。研究人员开发了各种新型纳米标志物：

（1）有机染料

荧光的产生和分子自身结构有直接关系，像分子结构中的共轭π键、平面刚性、取代基团、氢键等都会影响分子的荧光性能。荧光微球的研发过程中要充分了解荧光基团结构及影响因素，不同的荧光基团有不同的荧光性质。有机荧光染料价格低廉、种类较多，适用于多种材质的微球，不同批次间的荧光均一性较好。

（2）稀土配合物

稀土配合物是稀土元素与多种配体制成的配合物，其荧光寿命长、激发光和发射光的波长差（stokes位移）大、激发光谱和发射光谱无交叉。稀土配合物能够用镧系元素标记抗原或抗体进行时间分辨荧光免疫测定（TRFIA），利用波长分辨和时间分辨技术排除非特异荧光，实现高信噪比和灵敏度，并测量特异荧光，对待检物质进行定量分析。

（3）量子点

量子点（Quantum dots，QDS）主要是半导体Ⅱ－Ⅵ族或Ⅲ－Ⅴ族纳米晶体如 CdSe、ZnSe、InP、InAs 等组成的具有特殊电子性质与光学性质的半导体纳米粒子，QDs 可以和不同的生物分子结合，例如蛋白、抗体、适配体、寡核苷酸适配子等，然后形成一个兼具电化学特性和生物学特性的结合物在LFA模板中进行检测。

（4）上转发光材料

20世纪70年代，科学家们合成了一类反斯托克斯规则的发光材料UCP，由稀土元素掺杂某些晶体晶格构成。可通过多光子机制把长波辐射转换成短波辐射，且发射光的波长短于激发波长。UCP作为荧光标记物，与传统的荧光标记物相比具有以下优势：

①独有的上转换发光现象，降低了实验中的背景干扰，灵敏度较高；

②UCP由惰性材料合成，不易褪色，使LFA试纸条可以长期储存；

③ 因其强大的反斯托克斯位移效应，不同颜色的UCP 粒子可以被同一红外光激发，可用于同一样品的多元化分析。

（5）共轭聚合物

沿聚合物主链交替的单键和双键使共轭高分子（CPs）具备了独特的性能，如，任何轻微的干扰就有可能导致整个系统的荧光性能发生变化，用于检测便可使灵敏度大大提高，即“分子导线”效应。此外，与荧光染料相比，CPs由于具有结构可调性和聚集结构的差异性，更有可能在各种不同的环境下实现不同的检测任务。共轭聚合物作为荧光团，拥有许多独特的优点：如耐光漂白性，结构易于调整，和高的热/机械稳定性。

（6）聚集诱导发光材料

传统的荧光分子有着典型的聚集荧光淬灭效应(aggregationcaused quenching，ACQ)，所以在一定程度上限制了其应用。2001年唐本忠院士在五苯基噻咯衍生物中发现了聚集诱导发光(aggregationInduced Emission，AIE)现象，该类化合物在稀溶液单分子态时呈现弱的荧光，但在聚集态或固态下，荧光反而增强。AIE荧光物质能够显著抑制聚集荧光淬灭效应，在生物荧光成像领域展现出诱人的应用前景。常见的AIE荧光团有四苯乙烯(TPE)、硅杂环戊二烯、氰基苯乙烯等。但其制备过程复杂，成本较高限制了其应用。

四、荧光微球在侧向层析技术中的应用

侧向层析技术是20世纪90年代在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，具有快速、简便、单人份检测、经济的优点，现已广泛应用于医学检测、食品质量监测、环境监测、农业和畜牧业、出入境检验检疫、法医定案等领域。

侧向层析技术以大孔径的微孔滤膜(NC膜、硝酸纤维素膜) 为载体，将特异性的抗原或抗体固定在NC膜上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用侧向移动，与结合垫上的胶体金或微球标记的试剂发生特异的免疫反应，再移动到NC膜上，被固定在NC膜表面的抗原或抗体捕获，聚集在检测带上，通过目测硝酸纤维素表面标记物(胶体金或学胶颗粒)的光反射信号的密度得到直观的显色结果。其它未结合的标记物则越过检测带，流入吸水垫中，达到自动分离的目的。

对于荧光微球表面无任何功能基团修饰的微球，抗原或抗体通过被动吸附作用固定在微球表面，工艺简单。对于有功能基团修饰的荧光微球，抗原/抗体可通过共价交联的方式固定在微球表面。抗原/抗体的共价交联方法主要有两种，一种是两步法，交联前微球需先激活，例如-COOH羧基修饰的微球可用NHS/EDC活化；另一种是一步法，微球交联前只需更换缓冲液的pH值即可活化，操作十分方便。侧向层析示意图如下：

(I)荧光免疫纳米颗粒的合成，(II)侧向层析测试条的免疫分析机制和分析过程的示意图

Fig.3 The schematic representation of (I) the synthesis of fluorescent immune-nanoparticles, and (II) immunoassay mechanism of lateral flow test strip and analysis process.

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