从实验室到工业化：AAV载体生产的“层析革命”

腺相关病毒载体（Adeno-Associated Virus，AAV）

腺相关病毒载体是一类无法自主复制、不具有潜在致病性、无包膜的二十面体结构的病毒载体。其病毒颗粒直径约为20-30nm，含有4.7kb左右的线性单链DNA基因组。

AAV载体作为最有前途的病毒载体，在罕见病领域已经展现出良好的应用前景，包括SMA、年龄相关性黄斑变性(AMD)、血友病、AADC缺乏症等多种适应症，在临床上均有较大进展。

在过去十几年中，腺相关病毒（AAV）基因疗法的成功案例逐渐增多，大大增加了全球范围内CGT研发实验的热度，全球约69%的基因治疗试验处于临床I/II期，25%处于临床II期，而6%处于临床III期，预计到2025年，FDA每年将批准10～20个基因治疗产品，预估到2034年基因治疗市场的规模将达到$57.2 Billion。

截至2024年，全球已有多款基于AAV载体的基因治疗药物获批上市，主要应用于遗传性疾病的治疗。下表是主要AAV上市药物的信息汇总:

图1.全球获批AAV治疗药物汇总表

腺相关病毒（AAV）的组织亲嗜性（Tropism）由其衣壳蛋白（Capsid）结构决定，是基因治疗靶向性与疗效的核心。不同血清型（如AAV2、AAV8、AAV9等）通过与特定细胞表面受体结合，天然靶向心脏、肝、神经、视网膜等组织。目前已知13种AAV亚型及120余种变型，其Cap蛋白差异赋予各血清型独特应用优势，为遗传病、癌症等药物研发提供精准递送工具。

图2.AAV血清型亲嗜性组织分布

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腺相关病毒（AAV）载体生产关键挑战及层析解决方案

• 工艺标准化缺失：行业缺乏可放大、稳定的AAV生产平台，阻碍规模化进程；

• 上游放大难题：贴壁/悬浮培养体系难以兼顾高滴度与活性病毒生产；

• 下游纯化痛点：空壳病毒分离困难，血清型差异导致工艺复杂化；

• 质控标准空白：关键参数（如空壳率）缺乏统一检测方法，影响安全性评估。

图3.AAV载体生产工艺流程图

①Capture:AAV Affinity Beads 从细胞裂解液中捕获 AAV 颗粒:

工艺目标:去除HCP、核酸酶等工艺相关杂质，快速捕获AAV样品

使用亲和层析介质（AAV Affinity Beads 4FF）进行 AAV颗粒捕获（见图4），从滴度为 10¹⁰-10¹¹ vg/ml 的样品上清中，可以纯化获得高纯度的病毒，收率在 80% 以上，总量达到 10¹³vg。 

AAV Affinity Beads 4FF 亲和介质可满足用于基因治疗的腺相关病毒（AAV）的大规模纯化需求，对一系列 AAV 血清型均有结合作用，包括 AAV1 至 AAV9 以及合成血清型，一步纯化即可获得出色的纯度和产量。

图4. AAV Affinity Beads 4FF 纯化 AAV8 层析图谱

AAV Affinity Beads 4FF特性： 

• 高通用性: 适用于 AAV1~AAV9 血清型

• 高载量: 10¹² ~ 10¹⁴ vg/ml

• 高收率: ≥80%

• 高耐受性: 可耐受一定浓度的酸液、碱液和有机试剂

• 高安全性: 无动物源组分，临床应用安全，符合法规要求

• 高稳定性: 自主研发生产，从源头把控质量，确保产品批次的稳定

• 低成本: 标准的生产管理，节省成本，增强产品竞争力

• 易放大: 可耐受较高的流速，适合大规模纯化。

②Polishing:Smac Q40 分离空实壳AAV 颗粒

工艺目标:去除Partial和Empty capsids、病毒聚体等(空衣壳和不完整衣壳影响治疗效果，也会导致副作用和免疫反应)，进一步去除其他杂质（HCD、HCP、空壳片段等）

Partial capsids、Empty capsids 的存在不仅会影响治疗效果，还有可能导致免疫反应，因此，将它们去除变得至关重要。亲和层析步骤不能区分完整衣壳、空衣壳、不完整衣壳、病毒聚集体等，需要通过带电性差异进行精细分离，尽可能去除空衣壳等杂质；

精纯阶段对于填料的分辨率具有极高要求，利用完整衣壳与空衣壳之间等电点（PI）的微小差异，通过高分辨率阴离子Smac Q40层析来实现“空/实壳”分离（见图 5）。

通过亲和层析和离子层析后，能够有效去除空衣壳、不完整衣壳、聚体等杂质，得到完整的 AAV particles，完整衣壳率可达 90% 以上，满足 AAV 药物制备的需求。

为了更好地评估AAV药物的安全，稳定和有效性，需要对其纯度、滴度、效价、杂质残留等进行有效控制。

通用检测方法如下：

• 滴度测定：使用qPCR或ddPCR测定基因组滴度。

• 纯度检测：使用SDS-PAGE、HPLC或质谱分析检测HCP和HCD。

• 活性检测：通过体外或体内实验评估AAV的转导效率。

AAV生产中除完整病毒颗粒（Full）外，还会产生空壳（Empty）、部分基因组衣壳（Partial）、错误包装颗粒及聚集体等杂质。这些杂质不仅降低产品纯度，还会引发免疫反应、抑制转导效率、削弱药物效价，严重威胁AAV疗法的安全性与有效性，因此必须严格监控生产中的工艺与产品相关杂质。

图 6. AAV载体生产过程中所产生的病毒颗粒类型

（源自：https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.02.010）

AAV的空壳率可以通过多种方法来进行检测，不同的检测方法各有优劣（见图7）。

图 7. AAV空实壳质控检测方法对比

参考文献:

1.K. John Pasi NEJM 2020, J.R. Mendell NEJM 2017.

2.Bennett A, Patel S, Mietzsch M, et al. Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity. Mol Ther - Methods Clin Dev. 2017; 6:171–182.

3.Nam, Yu Ri, et al. "Distinguishing between DNA-Loaded Full and Empty Capsids of Adeno-Associated Virus with Atomic Force Microscopy Imaging." Langmuir (2023).

4.Heldt, Caryn L., et al. "Empty and Full AAV Capsid Charge and Hydrophobicity Differences Measured with Single-Particle AFM." Langmuir (2023).