本周分享 | 磁性微球在化学发光免疫分析中的应用

化学发光是免疫诊断的一种，是利用抗原抗体之间的特异性反应来测定体内疾病标志物浓度，从而判断人体身体状态的诊断方法，广泛应用于传染病、心脏疾病、肿瘤、妊娠检测等。

磁微粒化学发光法免疫分析是将磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术三者结合起来的一种新兴分析方法。是把磁微粒为固相载体，利用抗原抗体间的特异性反应检测待测物质。对于大分子抗体最常用的为双抗夹心法，原理为磁微粒与抗体偶联形成磁微粒抗体，将另一抗体与标记物偶联形成标记抗体，将磁微粒抗体加到待检测的样本中并与标记抗体结合，形成磁微粒抗体-抗原-标记抗体结合物，在磁场的作用下，经过反复洗涤，未参与反应的物质被去除，最后加入化学发光底物，就可以进行通过检测光子信号的强弱，通过标准曲线，计算得到待测物质的浓度含量。

按照标记物的不同，主要分为三类---直接化学发光、酶促学发光和电化学发光。

直接化学发光：将化学发光剂直接修饰到抗原或抗体表面，其化学发光剂具有能够产生发光现象的特殊基团，不需要酶催化便能直接参与发光反应。最常用的化学发光剂是吖啶类化合物。在碱性条件下，当化学发光启动剂如H2O2进攻了吖啶环C-9链上的取代基，该取代基即可与C-9和-OH发生反应，形成有张力的不稳定的二氧乙烷。然后二氧乙烷分解为处于电子激发态的中间产物N-甲基吖啶酮和二氧化碳。当中间产物重回基态时对外以光子的形式发射能量，即产生发光现象。

吖啶类化合物的最大发射波长为430 nm，光子产率很高，可达0.05；发光时间低于2 s，为闪光型发光。

吖啶类化合物的光子产率高，发光强度大，有利于提升检测灵敏度与精确性；又容易标记到蛋白质表面，且标记不影响光子产率。

酶促学发光：将催化化学发光反应的酶标记到抗原或抗体表面，加入待测抗体或抗原得到抗原抗体复合物，之后加入发光底物，在酶的催化作用下发光，最后用光信号测量仪对光强进行测定；常用辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)为标记酶，对应的发光底物分别是鲁米诺及其衍生物和1，2-二氧环己烷（AMPPD）。

1) 辣根过氧化物酶-鲁米诺系统（HRP-鲁米诺发光体系）

鲁米诺（Luminol）、异鲁米诺及其衍生物的发光原理为氧化反应发光。在过氧化物酶及化学发光启动剂（过氧化氢、氢氧化钠）存在的条件下，鲁米诺及其衍生物可被氧化为处于电子激发态的3-氨基邻苯二酸，当电子回到基态时即产生发光现象。鲁米诺的光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。

2) 碱性磷酸酶-1，2-二氧环己烷系统（ALP-AMPPD发光体系）

是以碱性磷酸酶（ALP）为化学发光催化剂，1，2－二氧环己烷衍生物（AMPPD）为碱性磷酸酶底物构成的酶促化学发光免疫反应体系。

发光为辉光型，波长为470nm，在15min时强度达到高峰，15-60min内光信号强度维持一致，变化很小，即使在12h后仍能测定得出正确结果。

电化学发光：通过电化学反应供能而引起的发光现象，发光底物三联吡啶钌，发光启动剂三丙胺（TPA），三联吡啶钌[RU(bpy)3]2+和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。

在磁微粒化学发光中，磁珠是非常重要的一种原料，其需要具有粒径分布均匀且单分散、磁响应性快、悬浮性好、非特异性吸附低、抗体偶联能力高等特点。

采用吖啶酯直接化学发光检测平台，我们评估了伯仪1μm、2.8μm羧基磁珠在D-dimer化学发光免疫检测应用。