武汉大学刘天罡组PNAS | 利用高效前体供给的酿酒酵母底盘系统挖掘真菌嵌合萜类合酶- 大数跨境

武汉大学刘天罡组PNAS | 利用高效前体供给的酿酒酵母底盘系统挖掘真菌嵌合萜类合酶

生辉SynBio

2021-07-16

导读：遇见-摘要I型嵌合萜类合酶是存在于真菌体内一类独特的萜类合酶家族，由异戊烯基转移酶（prenyltransf

遇见-摘要

I型嵌合萜类合酶是存在于真菌体内一类独特的萜类合酶家族，由异戊烯基转移酶（prenyltransferase，PT）结构域和I型萜类合成酶(terpene synthase，TS)结构域组成（简称为PTTS）。随着基因组测序技术的发展，几百个PTTS浮出水面，然而至今仅有大约20个PTTS的功能被验证。有限的数据使得我们难以对这一类稀有萜类合酶的起源、功能进化等进行深入且全面的探索。武汉大学刘天罡教授课题组联合美国田纳西大学陈峰教授课题组对PTTS这类罕见的萜类合酶家族的起源以及功能进化进行了深入且全面的探索。

遇见-内容

萜类化合物是广泛存在于自然界中、数量最庞大的一类天然产物家族，至今已超过10万种结构被发现。萜类合酶在萜类化合物生物合成途径中负责萜类骨架的合成，发挥了至关重要的作用。I型嵌合萜类合酶是存在于真菌体内一类独特的萜类合酶家族，其由一个C端异戊烯基转移酶（prenyltransferase，PT）结构域和一个N端I型萜类合成酶(terpene synthase，TS)结构域组成（简称为PTTS），主要负责二萜和二倍半萜的生物合成。随着基因组测序技术的发展，几百个的PTTS基因浮出水面，然而受限于米曲霉复杂的遗传操作、较长的培养周期以及大肠杆菌对于真菌来源的基因具有细胞毒性等特点，迄今为止仅有20个PTTS的功能被鉴定。为了解决上述问题，本研究利用代谢工程策略构建了一个二倍半萜前体高效供给的酿酒酵母底盘并结合高通量自动化平台对PTTS这类独特的嵌合萜类合酶的起源、功能进化及其生物学功能进行了系统探索（Fig.1）。

Fig 1. 已报道的PTTS产物的化学结构以及PTTS的的结构组成

研究者系统分析了NCBI和Uniprot数据库所有真菌来源的基因以及JGI数据库中已经基因组测序的476种真菌，从中筛选出了227个PTTS基因。通过生物信息学的手段对PTTS基因的起源和功能进化进行了探索，发现PTTS基因起源于双核亚界，主要分布于子囊菌中，担子菌中仅有一个种含有3个PTTS基因。担子菌中PTTS基因的缺失有可能是基因进化过程中经历了频繁的基因丢失导致的（Fig.2）。

Fig 2. JGI、NCBI和UniProt数据中的PTTS基因的分析

为了进一步理解它们进化的关联性，研究者对227个PTTS基因进行了系统发育分析，将其分为7个分支(A至F)。处于A、E和F亚家族中的基因形成Clade I，催化A型(C1-IV-V)环化，通过在GFPP的C1-C11/C10-C14之间环化，形成5-15环系。其余亚家族的基因形成Clade II，催化B型(C1-III-IV)环化，通过在GFPP/GGPP的C1-C15/C14-C18处环化而生成5-11环系。值得一提的是，在6个亚家族中，每个亚家族都有90%以上的PTTS基因功能未知，证明大量的PTTS催化功能的仍然是未知的（Fig.3）。

Fig 3. 227个PTTSs的系统发育分析

基于已报道的PTTS的功能，发现PTTS主要产生二倍半萜化合物。因此研究者利用代谢工程策略，在实验室前期构建的高产萜类化合物的酿酒酵母S. cerevisiae YZL141的基础上过量表达GFPP合成酶和PTTS，构建了一个高产二倍半萜的酵母底盘。该底盘一方面增加GFPP的代谢通量，使得二倍半萜嵌合酶的功能得到快速鉴定，一方面助力于释放二萜嵌合酶利用GFPP的潜力，使得二萜嵌合酶在生成二萜的同时还可能产生二倍半萜。此外，研究者利用高通量自动化平台批量构建了74个PTTS的酵母工程菌株，该平台的应用大大加快了PTTS的挖掘进程。利用该策略成功鉴定34个新PTTS的功能，该研究中鉴定的PTTS的总数超过了目前所有已知PTTS的一倍。研究者利用GC-MS、HR-EI-MS、NMR、量子化学以及化学反应等方式从34个PTTS的酵母工程菌株中共鉴定了24个二萜和二倍半萜产物，其中包括两个结构新颖的二倍半萜sesterevisene (1)和sesterorbiculene (2)。另外，24个产物中有11个是已报道的PTTS的产物，例如ophiobolin F (15)是AcOS的产物，fusicocccadiene（17）是PaFS的产物，这表明这类酶在功能上具有一致性；5个产物是已报道的植物来源二倍半萜合酶的产物，如variculatriene A (3) 和 (-) - variculatriene B (7)是拟南芥（Arabidopsis thaliana）来源的AtTPS25和AtTPS19^Y428D的产物；另外还有1个产物，spiroviolene (21)是已报道的细菌（Streptomyces violens）来源的二萜合酶（SvS）的产物，这些结果为真菌、植物和细菌中的基因功能的趋同进化提供了明确的证据。（Fig.4）。

Fig 4. 34个PTTS的系统发育分析以及产物结果

本研究系统探索了PTTS的起源和功能进化，为存在于真菌中的PTTS提供了一个全面的概况，扩充了PTTS这类罕见的嵌合萜类合酶家族的数量以及萜类产物的结构库，为相关产物的生物合成基因簇的后续研究奠定坚实的基础。另外，该研究中的策略不仅为萜类化合物的挖掘提供了一个强大且高效的方法，并且将天然产物的发现从原来在自然界寻找，发展为从网上挖掘信息并通过自动化实现，标志着萜类天然产物挖掘进入一个新的阶段。

该研究由武汉大学药学院邓子新院士团队刘天罡教授课题组和美国田纳西大学陈峰教授课题组合作完成。药学院博士研究生陈蓉为第一作者，刘天罡教授、卞光凯特聘副研究员和陈峰教授为共同通讯作者。该研究得到合成生物学国家重点研发计划，国家自然科学基金，武汉大学医学科学进步计划和中央高校基本科研经费的资助。

导师介绍

刘天罡，2010年至今任武汉大学药学院教授，教育部新世纪优秀人才、楚天学者特聘教授，博导。作为项目负责人获得国家重点研发计划“合成生物学”专项资助，中组部万人计划青年拔尖人才计划、中组部万人计划领军人才、2019年湖北省科学技术进步奖一等奖。主要研究领域为代谢工程和合成生物学方向，注重天然产物高产机制研究和新化合物高通量挖掘的方法开发。目前发表包60多篇SCI论文。担任ACS Synthetic Biology编委，Metabolic Engineering Communications副主编。

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