噬菌体，作为一种细菌病毒和高度进化的纳米机器，可以识别细菌细胞壁，转移遗传信息，特异性地杀死或者改造其宿主。噬菌体的研究和使用最早可以追溯到 100 多年前的东欧和苏联。但直到现在，噬菌体才作为一种颇具潜力的抗击耐药细菌的微生物病毒被全世界所重视。
从理论上来说，噬菌体在环境中数量众多（总量在 10^31，超过其他所有生物体的总和，是维系生态系统中的细菌数量的决定性力量），而且每一种细菌都有对应的噬菌体。但是，筛选用于临床治疗的噬菌体有着严格的标准。一些公认的条件是：选择裂解性噬菌体以有效杀死每一个致病性细菌；噬菌体不转移细菌 DNA 片段并且不编码任何毒素、毒力因子或抗生素抗性基因。此外，每个用于治疗的噬菌体都应该在基因组和蛋白质组水平以及与其宿主相互作用水平上进行充分表征；噬菌体应该有效地裂解目标细菌，具有尽可能广泛的宿主谱，以防止细菌对噬菌体耐受的迅速产生；在储存条件下和细菌识别部位互作足够稳定，能够克服至少一种细菌噬菌体抗性机制；不会导致人体不良的免疫反应。尽管已经有成千上万的噬菌体被发现，但是却鲜有符合以上标准，或者说是很少有噬菌体在进入临床使用前都经过这些条件的检验，所以在噬菌体进入临床使用之前建立一个信息完善的噬菌体库就十分重要。
既然噬菌体治疗使用的噬菌体有这么多门槛，那能否对天然噬菌体进行改造呢？长期以来，基因工程噬菌体的使用受到噬菌体展示方法和基础研究的限制，主要原因是噬菌体的改造是一个复杂而且耗时的工作，而且只能对一些已经研究透彻的模式噬菌体进行改造。近些年，随着测序技术和分子生物学的进一步发展，也为一般噬菌体的改造提供了高效的工具。工程噬菌体的发展在噬菌体生物制剂控制耐药菌、病原体检测、药物开发等领域得到广泛的应用。
那么工程噬菌体相对于天然噬菌体在临床使用中究竟有着怎样的优势呢？
避免噬菌体抗性的产生
根据以往的科学研究发现细菌已经进化出许多噬菌体抗性机制，阻止噬菌体的吸附、感染和增殖，大大降低了噬菌体清除目标细菌的能力。而工程噬菌体似乎可以很好地应对这些抗性机制。例如，限制修饰系统（Restriction–modification System）和 CRISPR-Cas 系统（CRISPR-Cas Systems）能对注入细菌的噬菌体基因组进行特异性切割。而通过基因改造将甲基转移酶基因引入噬菌体基因组，噬菌体可以提高它们对编码相应限制酶的菌株的感染效率并激活宿主自杀反应；而最近发现的噬菌体编码的抗 CRISPR 蛋白（Anti-CRISPR protein）也可以用于噬菌体改造。还有研究者为噬菌体配备在宿主裂解时释放的杀菌有效载荷蛋白，可以在克隆扩增发生之前及早去除这种有限数量的耐受细胞。我们已经知道，在溶源性噬菌体启动溶源反应时，可以通过一种称为同源免疫的机制（Homo-Immunity）快速诱导对流产感染具有抗性的细菌产生。因此，溶源性噬菌体通常不适合用作抗菌剂。而为了解除这种限制，可以通过修改溶源性噬菌体基因组以构造合成的、严格裂解（毒力）的噬菌体衍生物，从而大大提高杀死宿主细胞的效率（这是一种被称为 “毒力转化” 的策略）。
图 1：通过不同策略对噬菌体进行基因组编辑的一般示意图
加强噬菌体使用的安全性
许多天然噬菌体编码毒力因子或毒素，因此也不能用于任何抗菌应用。这个重要的安全问题可以通过从噬菌体基因组中精确去除潜在的危险遗传信息来解决。此外，噬菌体引发的裂解可导致细菌毒素、脂多糖和其他病原体相关分子模式 (Pathogen-associated Molecular Patterns，PAMP) 的释放，从而触发人体先天免疫反应或造成其他损害。工程化的、裂解缺陷的噬菌体衍生物可以杀死靶细胞而不释放 PAMPs 可用于减轻这些潜在的有害影响。一般来说，噬菌体在感染部位复制的能力被认为是支持其功效的重要特性。即使最初只有少数噬菌体到达感染部位，这种自我放大效应也可能达到成功治疗的效果。其实，在某些应用中使用工程化的、复制缺陷的噬菌体可能是可取的，因为它可以精确计算使用剂量并保证工程化病毒不会释放到环境中。
图 2：构建抗菌噬菌粒，导致细菌的非裂解性死亡
另一个关于噬菌体安全性的顾虑是，噬菌体的转导能力会介导抗生素抗性基因的传播。通常，能识别用于基因组包装的高度序列特异性 pac 位点的噬菌体会执行序列特异性终止切割或在感染早期（例如 T4 噬菌体）完全降解宿主 DNA，并且不太可能出现普遍转导。因此，通过末端酶的靶向修饰或宿主 DNA 降解核酸酶的递送，可以设计和优化这些特征。
基因组特异性毒性
图 3：由噬菌体颗粒 (ΦRGN) 递送的 RGN 构建体表现出高效且特异性的抗菌作用
经过改造过的基因组或者噬菌粒递送序列特异性的 CRISPR-Cas 的核酸酶，噬菌体可以切割指定的核苷酸序列和基因型。比如，宿主细胞携带的抗生素抗性基因和特定的毒力因子基因。基因组特异性毒性的方法最终可以清除致病菌而不干扰正常的菌群，该研究已经在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌证明有效。
报告噬菌体用作病原菌检测
图 4：luxAB 报告基因（编码荧光素酶蛋白）被整合到噬菌体基因组中，形成 "luxAB-tagged" reporter phage
这些报告噬菌体所用报告系统具有很高的灵敏性，允许快速检测极少数细菌细胞。荧光素酶是最常用的报告基因。报告噬菌体的一个关键优势是只有当存在活的靶细胞时才会产生信号。此外，报告基因 - 噬菌体检测通常是比依赖细菌培养的诊断快得多，因为细菌富集程序可以显著缩短或完全省略。
加强应用于人的噬菌体治疗
当从体外实验转化为治疗全身和局部感染时，许多因素将决定治疗的成功，包括：颗粒抗原性、噬菌体清除动力学、组织靶向和靶向细胞内病原体的能力。这些研究已经在进行中，比如，在衣壳蛋白上特定位置进行改造的 λ 噬菌体在血液中存在的半衰期大大延长。这个特征完全可以用于其他类型的噬菌体用以治疗系统性的感染。在最近的另一项研究中，经过基因改造的 T7 噬菌体增强了对 PH 的耐受，这一策略说明口服噬菌体可以通过胃肠道的酸性隔室输送。组织靶向是提高局部噬菌体浓度并且有可能清除胞内致病菌的策略，靶向药物起初研究其实是为了递送治疗药物（药物和基因）。根据已有的研究可以设计靶向组织的治疗性噬菌体。以下方式可以实现细胞内或组织特异性靶向：噬菌体展示库选择、细胞穿透肽或组织特异性归巢肽。目前一些工程噬菌体已经具有了惊人的穿越血脑屏障的能力，拥有这些能力的噬菌体为治疗神经性的疾病，如阿尔兹海默症和多发性硬化，开拓了道路。
噬菌体在靶向治疗中的应用已经多次显示出调节肠道微生物群的能力。某些噬菌体能够与肠道粘液层相互作用，从而增加黏膜表面的噬菌体浓度，并促进噬菌体滞留和对病原菌的清除。在 T4 样噬菌体中，这种粘附表型是由衣壳装饰蛋白 Hoc 介导的。这种粘液粘附表型也可以在其他噬菌体中进行改造用于肠道微生物组治疗。本文目前为止提到的研究，已经证明了工程噬菌体遗传学的一些临床潜力。噬菌体作为最大的未知功能的基因库，以及用于删除或修饰噬菌体基因的有效工具，最终将加深我们对多功能、自我复制的纳米机器的理解。
来源丨上海噬菌体与耐药研究所
参考文献：
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