1908 年，日本东京帝国大学教授池田菊苗注意到，柴鱼片和海带的汤均具有一种特别的“鲜味”，经鉴定，该增味特性是由L-谷氨酸产生的。这种让食物变美味的产品迅速受到人们追捧。第二年，日本味之素公司开始通过水解麦鼓和大豆蛋白质工业生产 L-谷氨酸。
时间来到 1957 年，木下祝郎博士等分离得到一株 L - 谷氨酸产生菌，开始用发酵法工业生产 L - 谷氨酸，不久，又利用该菌的突变株发酵生产了 L - 赖氨酸、L - 鸟氨酸和 L - 缬氨酸等。从此，各种氨基酸发酵的研究蓬勃发展，成本大幅度下降，同时产量大增。
如今，氨基酸广泛应用于食品、医药、饲料、化学工业、农业和化妆品等领域。数据显示，2020 年，世界氨基酸市场规模达到 980 万吨，到 2026 年预计将达到 1310 万吨。市场规模的不断扩大，继而转化为对工业生产上高产菌株的更高需求。
“在氨基酸发酵生产中，工业菌种是芯片，但是从一个野生的微生物，创制出一个高性能的工业菌种还是相对困难的。原因有两点，其一，自然生物以生长最大化分配其代谢流，要实现目的产物的定向合成，需要对代谢流进行精细调控；其二，产物在细胞内大量积累会造成严重的抑制或毒性，需要把细胞内的产物快速地、专一性地外排到细胞外。要实现这些，高效的基因编辑与元件挖掘技术是基础。” 天津工业生物所王钰博士告诉生辉 SynBio。
本次，生辉 SynBio 邀请到王钰来与大家分享其团队最新的研究进展和下一步的研究方向。
王钰从山东大学获得学士和硕士学位后，进入上海交通大学生物学专业继续深造，师从微生物代谢领域知名学者、美国国家发明家科学院（NAI）Fellow 许平教授。2016 年博士毕业后，他加入中科院天津工业生物技术研究所孙际宾研究员和郑平研究员的团队，目前担任中科院系统微生物工程重点实验室副主任，主要从事系统与合成生物技术研究，聚焦谷氨酸棒杆菌等工业微生物菌种的设计构建方法创新，包括高通量自动化的基因编辑技术，多基因组合精细表达调控技术、生长偶联的高通量筛选技术等，应用出口包括甲醇等碳一原料的生物转化利用和氨基酸等高值产物的生物合成。
谷氨酸棒状杆菌是重要的工业微生物之一，1957 年首次作为谷氨酸的生产菌被发现，之后被广泛用于制造 L - 谷氨酸、L - 赖氨酸、L - 异亮氨酸等氨基酸，成为全球氨基酸发酵工业的主要生产菌。作为工业生产菌种，谷氨酸棒杆菌具有耐受高强度发酵的鲁棒性、环境适应性强、代谢速度快和生长快等特点，且被美国 FDA 认为是生物安全菌。“ 传统的工业菌种育种方法主要基于诱变筛选，随着基因组测序、基因编辑等技术的不断完善，基因编辑育种正在成为主要的菌种创制技术。”
因此团队决定以谷氨酸棒杆菌合成 L - 脯氨酸为例，构建一个基于基因编辑的工业菌种从头创制技术流程。具体来说，就是以高效合成目标产物或者高效利用特定底物为目的，将野生菌种一步步改造成满足工业应用需求的菌种。
首先围绕目标产物 L - 脯氨酸，借助已有的谷氨酸棒状杆菌的基因组规模的代谢网络模型，利用研究所生物设计中心开发的算法进行计算，确定最为高效的代谢路径，绘制出菌种改造的 “蓝图”，然后以此为基准实施具体改造步骤。
构建工业菌株的代谢途径时通常涉及多个基因的表达，想要实现把天然微生物以生长最大化的代谢流重定向至目标产物的合成，需要多基因的组合表达调控技术，也就是一套基因编辑和调控工具。
王钰团队曾与研究所王猛研究员团队合作开发 BETTER 技术，可以同时实现十基因的组合表达调控（Wang et al. Nature Communications 2021）。该研究中他们还对谷氨酸棒杆菌中的 CRISPR 系统进行优化，在其 2017 年开发的 CRISPR/Cas9 基因编辑系统的基础上，进一步将准确率提高、编辑周期缩短，操作简化，同时降低对细胞的毒性。实现常规编辑效率最高 > 90%，219 kb 大片段敲除效率 > 30%，与现有方法相比均大幅度提升。
▲图丨使用优化的 CRISPR/Cas9 系统在谷氨酸棒杆菌中进行基因删除、插入和 ssDNA 重组（来源：论文）
除此之外，本实验的另一大突破是通过对产物 L - 脯氨酸、副产物和前体 L - 谷氨酸的外排进行调控，实现了 L - 脯氨酸的专一性外排。
物质合成反应发生在细胞内，除了少数类似于 PHA 的胞内产物，大部分的小分子产物均需排出到胞外。因此，高效的胞内合成仅是第一步，将产物高效地运至胞外，进入培养体系，再进行后续的产物提纯，是构成整个完整生产链条的重要步骤。
目前，大多数化合物能够实现胞外转运，但具体的转运蛋白却不甚明确，L - 脯氨酸的外排蛋白也尚无报道。想要加强 L - 脯氨酸的外排，同时避免副产物和前体 L - 谷氨酸的外排，解决方案就是系统鉴定 L - 脯氨酸和 L - 谷氨酸的外排蛋白，敲除副产物外排蛋白，强化产物外排蛋白。
团队利用 CRISPRi 系统，构建了一个全基因组规模，靶向所有 397 个转运蛋白的 CRISPRi 文库，高通量地发现谷氨酸棒杆菌中的 L - 脯氨酸运输蛋白，由此发现了第一个，也是目前唯一一个 L - 脯氨酸外排蛋白，通过转运工程实现产物的专一性外排。
据王钰介绍，文章投稿时，审稿人对这项研究工作给予了高度认可：“该研究创制了工业级别的 L - 脯氨酸生产菌，达到目前报道的最高水平，已经具有工业转化潜力；还有重要的一点是，其开发的技术流程对其他工业菌种的开发具有指导作用。” 这些正是团队开展这项研究的目的。
▲图丨构建基因组规模 CRISPRi 文库系统鉴定 L - 脯氨酸运输蛋白（来源：论文）
L - 脯氨酸是唯一一种含有仲胺的蛋白质氨基酸，是一种高附加价氨基酸。与 L - 赖氨酸和 L - 谷氨酸发酵生产的高产率（约 0.70 g/g 葡萄糖）相比，L - 脯氨酸目前的产率仅为约 0.20 g/g 底物。“供不应求” 让它的单价始终处于较高水平，应用也局限在保健品和医药领域。
随着全球人口的持续增长，人们对肉类和蛋奶制品需求也在不断增加。均衡的动物营养保证了人们健康的营养摄取，饲料工业越来越多地将氨基酸作为添加剂。根据中国饲料工业协会及全国畜牧总站数据显示，2016 年，我国饲料产量为 2.09 亿吨，同比增长 4.5%；到 2020 年，我国饲料产量达到 2.53 亿吨，同比增长 10.4%。
目前已有相关研究表明，L - 脯氨酸的添加有益于仔猪的生长和发育，同时还能提高瘦肉比。想要大规模开展应用，就要求 L - 脯氨酸的成本要足够低，即产量需要大幅度提高。此研究创制的工业菌种，通过提高 L - 脯氨酸生产水平有望降低生产成本，从而使其能够在饲料领域大规模应用。
“在这项研究中，最终的不含质粒、抗生素和诱导剂的菌株产生的 L - 脯氨酸产量达到 142.4 g/L，生产强度 2.90 g/L/h，转化率 0.31 g/g 底物，均为目前文献报道的最高水平。截至目前，经过进一步菌种改造，生产水平比文章发表时还要更高一些。”王钰说道。
当然，除了 L - 脯氨酸外，团队还有其他在研的氨基酸类产物的生产菌种。另外，团队还有一个重要的研究方向是生物制造的原料替代。
目前生物制造仍主要依赖糖类原料，而糖主要来自粮食。在中国，发酵用粮约占粮食总产量的 30%。找到发酵用粮的替代原料，避免生物制造 “与人争粮” 的问题，是生物制造产业可持续发展的关键。
目前，利用碳一原料的菌株尚未达到工业化应用水平，“不过，我们还在继续努力，希望能够在未来 1~2 年内提高到满足工业化和商业化要求的水平。”
谈到商业转化，王钰透露，“我们团队已有多个氨基酸、有机酸类的产品实现产业转化，最近开发的 L - 脯氨酸菌种也正在推进产业转化，正在开发的甲醇利用的菌种和生产技术，也是瞄准其未来的产业应用。”
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