萜烯是一系列萜类化合物的总称，是在许多植物中发现的芳香族化合物，为植物创造了特征气味，如大麻、松树和薰衣草。在自然界中，萜烯可保护植物免受动物或传染性细菌的侵害。
萜类在植物中的含量通常很低，且植物提取法还存在野生资源稀缺、分离效果不佳、产量极低的问题；化学合成法虽解决了植物提取法中的诸多问题，但仍存在原料昂贵、工艺流程复杂、立体选择性低、能耗高、污染大、总收率偏低等问题。相比之下，生物合成法不受原料的限制、生产过程绿色清洁、产物单一、产率提升空间大，具有很大的优势。
生物合成法又分为两种，一种是通过代谢工程手段直接在植物中促进萜类的合成；另一种是通过合成生物学在微生物等底盘细胞中合成目标产物。
近日，江南大学的团队在微生物底盘细胞 Candida glycerinogenes (C.glycerinogenes，产甘油假丝酵母) 中构建了合成萜烯的途径，通过过表达、基因敲低和反义 RNA 抑制等策略，萜烯的产量提高了近 16 倍，达到 6.0mg/L。相关文章以题为“Synthesis of pinene in the industrial strain Candida glycerinogenes by modification of its mevalonate pathway”发表在 Journal of Microbiology 期刊。
C.glycerinogenes 由江南大学诸葛斌实验室分离，具有自主知识产权，该菌株可以承受高温（42℃）、高乙醇浓度（20% V/V）、多种有机酸，并能产生甘油（约 130g/L）。此外，C.glycerinogenes 拥有完整的甲羟戊酸 (MVA) 途径，可以潜在地用作萜类化合物合成的底盘细胞。
甲羟戊酸途径（Mevalonate pathway）是以乙酰辅酶A为原料合成异戊二烯焦磷酸和二甲烯丙基焦磷酸的一条代谢途径，存在于所有高等真核生物和很多病毒中。该途径的产物可以看作是活化的异戊二烯单位，是类固醇、类萜等生物分子的合成前体。
此外，经过简单的转化，C.glycerinogenes 可以高效利用原甘蔗渣水解产物，在相同条件下比酿酒酵母 S. cerevisiae ZWA46 产生更多的乙醇。在超高葡萄糖浓度（550 g/L）下，C.glycerinogenes 生长良好且优于其他酵母。
通常，在 MVA 途径的下游，存在与生长和代谢密切相关的途径，它们竞争碳源。如果下游通路太强，往往会导致细菌的旺盛生长，而不是相关产物合成。
本研究中，研究团队将蒎烯生产途径引入 C.glycerinogenes，蒎烯产量主要通过加强上游 MVA 途径和抑制下游途径副产物的产生来提高。此前，该实验室已经用 C.glycerinogenes 生产了 1194.6 mg/L 的香叶醇，香叶醇和蒎烯都是单萜类化合物，以香叶基焦磷酸盐 (GPP) 为前体。
▲图 | C. glycerinogenes 中蒎烯生物合成方案，黑色箭头表示天然途径，红色箭头表示代谢工程修饰途径
研究人员首先评估了 C.glycerinogenes 和 S.cerevisiae 对蒎烯的耐受性。当蒎烯>200 mg/L ，S.cerevisiae 无法生长，但 C.glycerinogenes 在该浓度下生长良好。
此外，研究团队对上述两种底盘细胞中甲羟戊酸和角鲨烯含量进行了测定。甲羟戊酸是 MVA 途径的重要中间代谢物，是生产异戊二烯的重要前提。甲羟戊酸水平对其下游产品的生产具有约束力；角鲨烯则是 MVA 途径下游的关键代谢物。最终发现C.glycerinogenes 中的角鲨烯含量是 S.cerevisiae 的 3 倍，团队猜测是因为 C. glycerinogenes 中的 MVA 途径更强。表明 C.glycerinogenes 更适合作为蒎烯合成的底盘细胞。
以甲羟戊酸为节点，MVA 途径可分为上游和下游途径。团队检查了增强上游和下游途径对角鲨烯合成的影响。加强上游途径后，角鲨烯的产量明显高于下游途径。这可能是因为上游代谢途径较弱，加强它可以提高甲羟戊酸含量，为下游萜烯合成提供足够的前体。因此，加强上游途径使 MVA 途径的代谢更加平衡，促进了角鲨烯的合成。
角鲨烯的大量积累也会减少蒎烯的合成。当反义 RNA 抑制角鲨烯的合成时，通过 MVA 途径的反馈调节，蒎烯产量为 5.1mg/L。
为了提高蒎烯的产量，团队将上游和下游通路独立增强，以检查对蒎烯合成的影响。上游通路主要通过过表达 ERG10、ERG13 和 tHMGR 来增强，下游通路主要通过过表达 ERG12、ERG8 和 IDI1 来增强。在第⼀种情况下，蒎烯产量为 4.1mg/L，在第⼆种情况下，蒎烯产量为 3.1mg/L。
乙酰辅酶 A 是酵母代谢中最重要的代谢中间体，也是 MVA 途径的起始材料。因此，加强乙酰辅酶 A 合成可以增加 MVA 途径中的碳流量，并在蒎烯的下游合成中发挥关键作用；而甘油和乙醇是对蒎烯合成具有强烈影响的两个主要副产物，通过抑制甘油或乙醇，蒎烯产量分别达到 4.7 mg/L 和 4.45 mg/L。当甘油、乙醇和角鲨烯的合成途径同时被抑制时，蒎烯产量为 6.0 mg/L。
总之，利用代谢工程，江大团队构建了在 C.glycerinogenes 中合成蒎烯的途径，通过修饰 MVA 途径，增强上游途径和抑制下游角鲨烯的合成，抑制乙醇和甘油的合成，显着提高了蒎烯产量。
论文中，团队也表示下⼀个重点是蒎烯合酶的合理设计和修饰，以提高其与其底物 GPP 的结合能力。此外，角鲨烯和蒎烯的联产发酵可能是未来的一个方向。
参考资料：
1.https://patents.google.com/patent/CN107723300A/zh
3.https://www.baike.com/wikiid/6984896272574579886?from=wiki_content&prd=innerlink&view_id=5adfxi7nw5o000
4.http://biotech.jiangnan.edu.cn/szdw1/jzyg/zg1/zgb.htm
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