元英进团队发文，利用工程化酵母实现咖啡酸衍生物的合成- 大数跨境

近年以来，苯乙酯（CAPE）和苯乙酰胺（CAPA）由于具备抗氧化、抗炎和抗癌等广泛的生物治疗活性，获得了广泛关注。其中，微摩尔浓度级别的苯乙酯对于多种癌症具有抑制作用，而苯乙酰胺则能够表现出强大的抗氧化能力。

然而，该两类分子作为咖啡酸（CA）的衍生物，其天然来源十分有限，采用化学合成方法也存在环境毒性等种种不利因素。因此，相关研究者提出利用微生物细胞工厂，以实现该两类产品分子的大规模制造。

日前，天津大学系统生物工程教育部重点实验室主任元英进院士及其团队在 ACS Synthetic Biology 期刊发表最新论文 Yeast Metabolic Engineering for Biosynthesis of Caffeic Acid-Derived Phenethyl Ester and Phenethyl Amide。

该研究通过理性的代谢通路设计和基于文库 SCRaMbLE 方法对酵母细胞进行组合优化，以合成 CAPE 和 CAPA。值得注意的是，该论文首次报告了 CAPA 在工程酵母细胞中的从头合成。

（来源：ACS Synthetic Biology）

该项研究中，该团队基于先前在酵母中成功生物合成咖啡酸的工作，进一步在酵母中构建了苯乙酯和苯乙酰胺的下游合成途径。最终，研究团队分别获得能够生产两类化合物的最佳菌株，产量分别为苯乙酯 417μg/L，苯乙酰胺 1081μg/L。与此同时，还筛选到两个基因靶点 ΔHAM1 和 ΔYJL028W，其有助于提高目标产物的合成能力。

早在 2019 年，元英进团队曾成功利用工程化酵母合成咖啡酸。本次研究在其基础之上，首先引入酶类 At4CL 构建咖啡酰辅酶 A 合成路径，继而在 O-ATF 或 N-ATF 的帮助之下，使咖啡酰辅酶 A 与 2-PE 或 2-PA 发生酶促酯交换反应。

最终，构建 CAPE 合成途径涉及 PaHpaB、SeHpaC、KivD、Eht1、At4CL 和 RtTAL 六个基因表达盒，而构建 CAPA 合成途径则涉及 PaHpaB、SeHpaC、KivD、LbPDC、CaTHT 和 RtTAL。

▲图丨酵母中构建 CAPE 和 CAPA 合成途径（来源：ACS Synthetic Biology）

接下来，研究人员通过向工程化酵母中添加葡萄糖，以进行酵母合成 CAPE 和 CAPA 通路测试，结果发现在两条路径中都没有检测到最终产物。研究者推测这可能是由于酵母细胞提供的芳香底物不足所导致。因此，其通过添加其余特定的底物以验证酵母细胞表达酶的活性。

结果表明，在 CAPE 途径中，通过添加苯乙醇和咖啡酸能够检测到最终产物；而在 CAPA 途径中，当对香豆酸和咖啡酸同时存在时，4CL 会优先催化对香豆酸，导致最终生成对香豆酰苯乙酰胺（pCoPA）。

为了使细胞产生比对香豆酸更多的咖啡酸，研究人员构建了两个具有柔性连接肽 GGGGS 的融合基因，即 At4CL-linker-CaTHT 和 CaTHT-linker-At4CL。结果显示，两种融合蛋白的表达使 pCoPA 产量减半，并且含有 At4CL-linker-CaTHT 质粒的菌株能够合成 CAPA，但产量较低。

▲图丨通过优化工程改造的酵母菌株生产 CAPE 和 CAPA（来源：ACS Synthetic Biology）

由于酵母合成的芳香氨基酸远远不足以支持 CAPE 和 CAPA 合成，引入异源途径的工程酵母只有在培养基中加入特定的底物时才能合成相应的产物。为此，研究人员构建了含有酪氨酸和色氨酸下游合成途径的酵母菌，来直观地筛选芳香氨基酸合成上调的菌株。

通过六轮 SCRaMbLE 筛选，研究者得到芳香族氨基酸产量显著增加的菌落文库，并进一步分析了所选优势菌株芳香产物的调控变化，最终发现 ΔHAM1 和 ΔYJL028W 能够使两种芳香氨基酸的合成效率提高 2 倍以上。

除此之外，研究者还针对合成途径进行优化，以促进芳香环结构的合成。总之，在酵母中构建咖啡酸合成体系的基础上，该研究首次实现在酵母上从头合成 CAPE 和 CAPA，其产量分别为 417μg/L 和 1081μg/L。

当前进展成功利用微生物细胞工厂生产咖啡酸衍生物，其为具有类似结构的抗氧化和抗癌产品的制造提供了重要的思路。

参考资料：

1.https://doi.org/10.1021/acssynbio.3c00413

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