白屈菜红碱（Chelerythrine）是一种重要的生物碱，它是罂粟科（Chelidonium majus L.、Sanguinaria canadensis L.、Macleaya cordata (Willd.) R.Br.）和芸香科（Zanthoxylum asiaticum L.）植物中发现的主要功能成分，具有显著的抗菌、抗炎和抗氧化活性，已被用作动物生产中的促生长饲料添加剂，还被用作生物农药来预防和控制农作物病情。
由于其结构复杂，实现白屈菜红碱的全化学合成具有挑战性。目前，白屈菜红碱的生产主要依赖于直接植物提取，但产量较低（ 0.01–0.1％ 干重）。这些局限性限制了其工业和临床应用。利用微生物细胞工厂有望实现白屈菜红碱的可持续生产。
此前，有研究人员揭示了博落回（Macleaya cordata）中白屈菜红碱的生物合成途径，该途径包括从 (S)- 网状番荔枝碱开始的 8 个催化步骤：BBE 催化从 (S)- 网状番荔枝碱到 (S)-scoulerine 的第一个立体特定氧化和碳-碳键形成步骤，(S)-scoulerine-9-O-methyltransferase (SMT) 和 TNMT催化 (S)-scoulerine 和 (S)-canadine 甲基化成 (S)-tetrahydrocolumbamine 和(S)-N-methylcanadine，(S)-tetrahydrocolumbamine、(S)-N-methylcanadine 和 allocryptopine 被 P450 酶 (S)-canadine synthase (TDC)、MSH 和 P6H 氧化，分别生成 (S)-canadine、allocryptopine 和 6-hydroxyallocryptopine，6-hydroxyallocryptopine 自发转化为二氢白屈菜红碱，二氢白屈菜红碱在 DBOX 催化下被氧化为白屈菜红碱。
（来源：Microbial Cell Factories）
具体来说，研究人员通过在酿酒酵母 W303-1A 中异源表达七种植物来源的酶（McoBBE、TfSMT、AmTDC、EcTNMT、PsMSH、EcP6H 和 PsCPR），获得了能够产生白屈菜红碱的第一代菌株 Z4。此外，通过整合多拷贝限速基因（TfSMT、AmTDC、EcTNMT、PsMSH、EcP6H、PsCPR、INO2、AtATR1）、血红素和 NADPH 调控以及异源表达 MtABCG10 调控产物运输等高效代谢工程，增强白屈菜红碱生物合成的代谢通量。结合培养工艺，在 0.5L 生物反应器中产量达到 12.61 mg/L，较第一代重组菌株产量提高 37000 多倍。
在这项工作中，研究人员首先在酿酒酵母中重建生物合成白屈菜红碱的催化模块。将来自罂粟科植物的参与白屈菜红碱及其前体合成的异源基因（包括 McoBBE、AmSMT、AmTDC、PsTNMT、PsMSH、PsP6H、McoDBOX 和 PsCPR ）引入菌株 Z0 并使其表达。
将菌株 Z0 在 10 mL 试管中以 28 ℃ 培养 10 天后，由于代谢途径中的酶不平衡，LC-MS 无法检测到白屈菜红碱的积累，这表明参与催化该途径的酶活性可能存在缺陷。
针对这一问题，研究人员进行了多酶筛选和优化。已知 BBE 是血根碱生物合成途径中的限速酶。通过对比来自罂粟科植物的 4 种 BBE，分别是Papaver somniferum PsBBE、Argemone mexicana AmBBE、Eschscholzia californica EcBBE 和 M. cordata McoBBE，发现 M. cordata McoBBE 的催化效率最高，在菌株 Z0(McoBBE) 中催化 (S)- 网状番荔枝碱到 (S)-scoulerine 的转化效率为 21.92%。
SMT 催化 S-adenosyl-L-methionine 生成 (S)-tetrahydrocolumbamine。筛选出 4 个 SMT，包括 A. mexicana AmSMT、Coptis chinensis CcSMT、P. somniferum PsSMT 和 Thalictrum flavum TfSMT 突变体，并在菌株 Z0 中进行异源表达。在这些候选菌株中，TfSMT 突变体表现出色。为了优化该过程的关键酶，研究人员采用基于底物结构相似性及酶同源物的酶筛选策略，表征了不同植物来源的 TNMT 和 P6H，结果表明，来自 E. californica 的 EcTNMT 和 EcP6H 有效提高了白屈菜红碱的产量。
综上，筛选得到白屈菜红碱合成途径中 4 种催化效率较高的酶（tMcoBBE，TfSMT，EcTNMT，EcP6H），完成了人工生物合成途径的初步构建，第一代工程酵母的产量为 0.34 µg/L 白屈菜红碱。
图丨酿酒酵母中从 (S)-网状番荔枝碱到白屈菜红碱的生物合成途径（来源：Microbial Cell Factories）
研究人员将酿酒酵母中从 (S)- 网状番荔枝碱到白屈菜红碱的生物合成途径划分为三个功能模块，按模块进行优化。
模块 A 是碳-碳键形成模块。针对该模块，将 tMcoBBE 插入到菌株 Z0 的染色体中，生成工程酵母 Z1，Z1 由 (S)- 网状番荔枝碱生物合成 (S)-scoulerine 的转化率为 28.62%。
模块 B 包括 SMT 和 TDC，这两种酶对于将 (S)-scoulerine 转化为 (S)-canadine 至关重要。将 TfSMT 突变体、AmTDC 和 P. somniferum PsCPR 基因表达盒整合到 Z0 中，产生了菌株 Z2。当将 100 µM (S)-scoulerine 添加到 SC 培养基中时，菌株 Z2 合成 (S)-canadine，滴度为 9.91 mg/L。
模块 C 从 (S)-canadine 合成白屈菜红碱，涉及四种酶：TNMT、MSH、P6H 和 DBOX。因此，将编码 EcTNMT、PsMSH、EcP6H、McoDBOX 和 PsCPR 的密码子优化的表达盒整合到菌株 Z0 中，产生菌株 Z3；将编码除 McoDBOX 外其它密码子优化的表达盒整合到菌株 Z0 中，产生菌株 Z3' 。经比较，在合成白屈菜红碱水平相当的情况下，Z3' 的生长速率较高，因此选择菌株 Z3' 作为构建白屈菜红碱合成途径的平台菌株。
为了构建能够利用 (S)-网状番荔枝碱合成白屈菜红碱的菌株，通过整合编码 tMcoBBE、TfSMT 和 AmTDC 的基因表达盒，对菌株 Z3' 的基因组进行改造，产生菌株 Z4。Z4 可以成功生产滴度为 0.34 µg/L 的白屈菜红碱，符合白屈菜红碱标准。
接下来，研究人员通过整合多拷贝限速基因对白屈菜红碱生物合成途径进行微调，以提高目标产物的产量。
首先，利用质粒 pRS416 在菌株 Z4 中过表达单个基因 tMcoBBE、TfSMT、AmTDC、EcTNMT、PsMSH 和 EcP6H，结果发现，所有代谢基因的过表达均不同程度地提高了白屈菜红碱的产量。
然后，增加 P450 活性相关基因（INO2、PsCPR）的拷贝数，结果显著地提高白屈菜红碱的合成。
为了进一步促进白屈菜红碱的合成，将多基因盒 A（包括限速基因TfSMT、AmTDC、EcTNMT、PsMSH、EcP6H、PsCPR 和 INO2）整合到菌株 Z4 的基因组中，添加这些基因的多个拷贝以生成菌株 Z5-Z9，结果显示，这些菌株的白屈菜红碱滴度显著提高，菌株 Z9 的产量为 29.15 µg/L，比菌株 Z4 高出约 83 倍。
在菌株 Z9 中进行了第二次限速基因筛选，以进一步优化代谢途径。在菌株 Z9 中过度表达单个基因tMcoBBE、TfSMT、AmTDC、EcTNMT、PsMSH、EcP6H、INO2、PsCPR 和 AtATR1，结果显示，只有在过度表达 MSH、ATR1 和 INO2 的菌株中，白屈菜红碱产量的增加才显著。因此，包括限速基因 MSH、ATR1 和 INO2 在内的多基因盒 B 被整合到菌株 Z9 中，产生了工程菌株 Z10–Z13 的不同拷贝。经过两轮多拷贝限速基因的迭代整合，获得了菌株 Z13，其白屈菜红碱产量最高，为 74.74 µg/L。
优化 P450 酶是增加白屈菜红碱产量的重要策略。研究人员针对血红素和 NADPH 的供应进行调节。
在组装活性 P450 全酶时需要足够量的血红素，研究人员通过强化限速酶、消除反馈抑制和减少血红素降解增加了血红素的供应。又通过调节戊糖磷酸途径增加了辅因子 NADPH 的供应。综合这些策略，白屈菜红碱的滴度大幅度提高，从 74.74 增加到 195.03 µg/L。
白屈菜红碱主要在细胞内积累，需要细胞外运输才能促进进一步的合成。研究人员将已鉴定用于生物碱的运输的四种转运蛋白分别整合到菌株 Z21 中，包括 M. cordata McoABC、Medicago truncatula MtABCG10、Catharanthus roseus CrTPT2 和 Coptis japonica CjABCB2，结果显示，整合了 MtABCG10 基因的改造菌株 Z22 能够有效降低胞内积累，从而提高胞外白屈菜红碱的积累，总滴度提高了 54.06% 至 303.74 µg/L。
最后，采用优化的培养基和接种浓度，即 YPD 培养基和初始接种浓度的 OD600 为 40，在 0.5 L 生物反应器中通过基于 pH 的补料分批发酵，在表现最佳的菌株 Z22 中，白屈菜红碱滴度提高到 12.61 mg/L，与使用简单组装途径的菌株 Z4 相比提高了 37000 多倍。
总的来说，本研究首次成功实现了酵母中白屈菜红碱的全生物合成，其合成效率显著高于大多数复杂的天然植物产物。
为了进一步提高合成效率，研究人员目前正在探索几个瓶颈问题的解决方案，包括底物供应不足、P450 酶的工程改造以及如何避免前体的积累。
参考资料
1.Zhu, J., Zhang, K., He, Y. et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for chelerythrine biosynthesis. Microb Cell Fact 23, 183 (2024).
2.Liu XB, Liu YS, Huang P, Ma YS, Qing ZX, Tang Q, et al. The genome of medicinal plant Macleaya cordata provides new insights into benzylisoquinoline alkaloids metabolism. Mol Plant. 2017;10:975–89.
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