点击蓝字关注我们
糖蛋白·质谱专家
Expert of Glycoproteomics & Mass Spectrometry
概述
N-糖基化是蛋白质上常见的翻译后修饰，发生在特征氨基酸序列 N-X-T/S/C（X≠P）中的天冬酰胺上。N-连接糖具有包含 2 个N-乙酰葡萄糖胺和 3 个甘露糖的五糖核心结构，由常见的单糖（图1）构成高甘露糖型、杂合型和复杂型等三种主要类型。N-糖基化在修饰位点上具有微观和宏观不均一性，在结构上具有单糖组成（单糖种类和数量）、序列结构、链接结构等多维结构特征；其功能与修饰位点和N-连接糖结构一一对应。
图1. 常见的单糖
图2. N-连接糖三种常见的类型
基于质谱的 N-糖蛋白分析可以在完整 N-糖蛋白、完整 N-糖肽、含 N-糖基化位点多肽、N-连接糖等分子水平上来开展（图3），不同分子水平的分析结果互为补充，全面地给出 N-糖基化的定性定量信息；助力位点和结构特异 N-糖蛋白结构和功能的研究；在 N-糖蛋白相关疾病诊断和预后标志物、药物靶点，高效靶向大分子药物等研究和应用中有着广泛的应用。
图3. 基于质谱的 N-糖蛋白分析的四个分子层次
参考文献：
1. Essentials of Glycobiology (4th edition),Editors: Ajit Varki, et al. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2022.ISBN-13: 978-1-621824-21-3 (hardback)ISBN-13: 978-1-621824-22-0 (epub).
2. 结构特异N-糖蛋白质组学研究进展。质谱学报, 2021, 42, 897-913.
3. Mass spectrometry-based qualitative and quantitative N-glycomics: an update of 2017-2018. Analytica Chimica Acta, 2019, 1091, 1-21.
4. Advancements in mass spectrometry-based glycoproteomics and glycomics. National Science Review, 2016, 3, 345-364.
5. Mass spectrometry-based N-glycoproteomics for cancer biomarker discovery. Clinical Proteomiccs, 2014, 11, 18.
✦
Part 1：完整 N-糖肽——位点和结构特异 N-糖基化分析
基于质谱的完整 N-糖肽分子水平上的 N-糖基化的定性定量分析，当前是复杂体系 N-糖基化位点和结构全面鉴定的最佳选择；能给出多肽骨架氨基酸序列、N-糖基化位点、N-连接糖单糖组成/序列/链接、对应的 N-糖蛋白等定性信息，实验组（疾病组）相对于控制组（健康对照组）位点和结构特异 N-糖基化相对变化等的定量信息。
实验流程：
1. 基本流程：蛋白酶酶切 → 完整 N-糖肽富集 → RPLC-nanoESI-MS/MS → 基于组成和结构指纹的位点和结构特异性数据库搜索与鉴定
2. 选项：1）RPLC离线预分离；2）HILIC在线分离；2）客户化蛋白酶；3）客户化富集材料；4）多肽骨架同位素标记
图4. 完整 N-糖肽 NITIVTGAPR_01Y41Y41M(31M41Y41L)61M61Y41L32S（左，变化倍数1.7±0.3）和 NITIVTGAPR_01Y41Y41M(31M41Y41L)61M61Y41L62S（右，变化倍数1.1±0.1）在三个技术重复中的积分色谱图（b，e，h），前体离子同位素指纹轮廓（a，c，d，f，g，i）和完整 N-糖肽图形解离图。（本图改编自Journal of Proteome Research 2019, 18, 2885-2895.）
图5. 完整 N-糖肽 MNITVK_01Y41Y41M(31M21Y(31F)41L32S)61M61Y41L32S（左，下调0.4±0.1）和 MNITVK_01Y(61F)41Y41M(31M41Y41L32S)61M61Y41L32S（右，上调1.5±0.1）的同位素指纹轮廓（a，b）和完整 N-糖肽图形解离图和结构诊断离子。（本图改编自Journal of Proteome Research 2019, 18, 2885-2895.）
参考文献：
1. Comprehensive site- and structure-specific characterization of N-glycosylation in model plant Arabidopsis using mass-spectrometry-based N-glycoproteomics. Journal of Chromatography B, 2022, 1198, 123234.
2. Structure-specific N-glycoproteomics characterization of NIST monoclonal antibody reference material 8671. Journal of Proteome Research, 2022, DOI: 10.1021/acs.jproteome.2c00027.
3. Site- and structure-specific characterization of N-glycoprotein markers of MCF-7 cancer stem cells using isotopic-labeling quantitative N-glycoproteomics. Chemical Communications, 2019, 55, 7934-7937.
4. Site- and structure-specific quantitative N-glycoproteomics using RPLC-pentaHILIC separation and intact N-glycopeptide search engine GPSeeker. Current Protocols in Protein Science, invited protocol, 2019, 97, e94.
5. GPSeeker enables quantitative structural N-glycoproteomics for site- and structure-specific characterization of differentially expressed N-glycosylation in hepatocellular carcinoma. Journal of Proteome Research, 2019, 18, 2885-2895.
Part 2：N-连接糖 —— 结构特异
N-糖基化分析
基于质谱的 N-连接糖分子水平上的 N-糖基化的定性定量分析，能给出 N-连接糖单糖组成、序列、链接等定性信息，实验组（疾病组）相对于控制组（健康对照组）结构特异 N-糖基化相对变化等定量信息。
实验流程：
1. 基本流程：糖苷酶酶切 → N-连接糖富集 → 全甲基化 → RPLC-nanoESI-MS/MS → 基于结构指纹的结构特异性数据库搜索与鉴定
2. 选项：1）客户化 N-连接糖酶切；2）客户化富集材料；3）还原端还原胺化同位素或等重标记
图6. 杂合型 N-连接糖的结构特异性鉴定（本图引自文献Journal of Proteome Research, 2019, 18, 372-378）
参考文献：
1. Serum N-glycomics of a novel CDG-IIb patient reveals aberrant IgG glycosylation. Glycobiology， 2022, 32, 380-390.
2. Rapid antibody glycoengineering in CHO cells via RNA interference and CGE-LIF N-glycomics. Methods in Molecular Biology, 2022, 2370, 147-167.
3. Comparative glycomics study of cell-surface N-glycomes of HepG2 versus LO2 cell lines. Journal of Proteome Research, 2019, 18, 372-378.
4. Large-scale identification and visualization of human liver N-glycome enriched from LO2 cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2018, 410, 4195–4202.
5. Large-scale identification and visualization of N-glycans with primary structures using GlySeeker. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2018, 32, 142-148.
Part 3：含 N-糖基化位点多肽——位点特异 N-糖基化分析
基于质谱的含 N-糖基化位点多肽分子水平上的 N-糖基化的定性定量分析，能给出多肽骨架氨基酸序列、N-糖基化位点等定性信息，实验组（疾病组）相对于控制组（健康对照组）位点特异 N-糖基化相对变化等定量信息。
实验流程：
1. 基本流程：蛋白酶酶切 → 完整 N-糖肽富集 → 糖苷酶酶切 → RPLC-nanoESI-MS/MS → 数据库搜索与鉴定
2. 选项：1）high-pH RPLC离线预分离及馏分组合；2）客户化蛋白酶；3）客户化N-连接糖酶切；4）同位素或等重标记定量
参考文献：
1. Plasma membrane N-glycoproteome analysis of wheat seedling leaves under drought stress. International Journal of Biological Macromolecules, 2021, 193, 541-1550.
2. Systems-wide analysis of glycoprotein conformational changes by limited deglycosylation assay. Journal of Proteomics, 2021, 248, 104355.
3. Site-specific N-glycosylation analysis of animal cell culture-derived Zika virus proteins. Scientific Reports, 2021, 11, 5147.
4. Glyco-CPLL: An integrated method for in-depth and comprehensive N-glycoproteome profiling of human plasma. Journal of Proteome Research, 2020, 19, 655-666.
5. An integrated strategy for high-sensitive and multi-level glycoproteome analysis from low micrograms of protein samples. Journal of Chromatography A, 2019, 1600, 46-54.
Part 4：完整 N-糖蛋白——位点
和结构特异 N-糖基化分析
基于质谱的完整 N-糖蛋白分子水平上的 N-糖基化的定性定量分析，优势是能全面获得整个 N-糖蛋白氨基酸序列以及所有修饰（包括不同位点 N-糖基化和其他翻译后修饰）的信息；能给出蛋白质骨架氨基酸序列、N-糖基化位点、N-连接糖单糖组成/序列/链接等定性信息，实验组（疾病组）相对于控制组（健康对照组）位点和结构特异 N-糖基化相对变化等定量信息。
实验流程：
1. 基本流程：nanoESI-MS/MS → 基于蛋白质骨架和 N-连接糖部分选择性解离的数据库搜索与鉴定
2. 选项：不同修饰位点 N-糖基化和其他翻译后修饰的同时鉴定
图7. 带高甘露糖 M5 的核糖核酸酶B N-连接糖部分在高能碰撞诱导解离中的选择性解离。（本图摘自文献Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2018, 32, 2031-2039）
图8. 带高甘露糖 M5 的核糖核酸酶 B 蛋白质骨架在混合 EThcD 模式下的选择性解离。（本图摘自文献Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2018, 32, 2031-2039）
图9. 带高甘露糖 M5 的核糖核酸酶 B 蛋白质骨架在混合 EThcD 模式下解离的图形解离图。（本图摘自文献Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2018, 32, 2031-2039）
参考文献：
1. Top-down tandem mass spectrometry on RNase A and B using a Qh/FT-ICR hybrid mass spectrometer. Proteomics, 2014, 1174-1184.
2. Selective fragmentation of the N-glycan moiety and protein backbone of ribonuclease B on an Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2018, 32, 2031-2039
3. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics, 2017, 152, 41-47.
4. Online hydrophilic interaction chromatography (HILIC) enhanced top-down mass spectrometry characterization of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain. 2022, 94, 5909-5917.
5. Structural O-glycoform heterogeneity of the SARS-CoV-2 spike protein receptor-binding domain revealed by top-down mass spectrometry. Journal of the American chemical society, 2021, 143, 12014-12024.
6. Proteoform profiles reveal that alpha-1-antitrypsin in human serum and milk is derived from a common source. Frontiers in Molecular Biosciences, 2022, 9, 858856.
糖百科
汉诺生物科技Hanol 订阅号特推出“糖百科”专题，向您传递糖科学（糖生物、糖合成、糖分析）和糖工程领域研究和应用信息。
下一期主题预告：常见糖蛋白糖苷酶
热忱欢迎糖科学和糖工程领域专家和同行赐稿。
联系我们
苏州市高新区竹园路209号1号楼
0512-66650185,18662643248
sales@hanol.com.cn（销售咨询）
tech@hanol.com.cn（技术咨询）
https://www.hanol.com.cn
（点击上方网址进入汉诺生物官网）
汉诺生物公众号
汉诺生物微信
扫描上方二维码
不错过糖蛋白专家的每一条推送！
你的好友汉诺拍了拍你
并请你帮他点一下分享