第一阶段：单细胞悬液制备与建库（湿实验关键点）
这是单细胞测序最困难、也是最容易引入批次效应的步骤。
1. 组织解离：
将实体组织（如肿瘤、脑组织）消化成单细胞悬液。
难点：必须保证细胞活性高，且不能有太多碎片，否则会影响后续凝胶微滴（GEMs，即凝胶微滴）生成。
2. 细胞捕获与条形码添加：
10x Genomics微流控技术：将单个细胞与含独特条形码（Barcode，即细胞条形码）的凝胶珠包裹在油滴中（GEMs）。
关键原理：每个凝胶珠上有大量引物，这些引物包含：
Cell Barcode：同一细胞的所有mRNA被打上相同的细胞身份证（区分细胞）。
UMI（Unique Molecular Identifier，即独特分子标识符）：每条mRNA分子被打上独特的分子身份证（用于去除PCR扩增带来的重复，实现绝对定量）。
3. 反转录与文库构建：
在GEMs内，mRNA被反转录为cDNA，此时cDNA已经带上了细胞条形码和UMI。
破油后，进行PCR扩增，然后构建测序文库。
第二阶段：测序与数据初步处理
测序完成后，你拿到的依然是FASTQ文件，但解读方式完全不同。
1. 原始数据质控
内容：与普通测序类似，检查测序质量、GC含量等。
软件：FastQC。
2. 数据初处理（Cell Ranger 核心步骤）
这是单细胞分析特有的第一步，通常使用 10x Genomics 官方的 Cell Ranger count 管道。
输入：FASTQ 文件。
参考基因组：需要提供基因组的FASTA文件和GTF注释文件。
主要任务（解复用）：
比对：将读段比对到参考基因组。
细胞区分：根据条形码区分哪些GEMs里真的有细胞，哪些只是空的油滴（背景噪声）。
UMI计数去重：利用UMI去除PCR重复，统计每个基因在每个细胞中实际有多少个独特的mRNA分子。
产出文件（关键）：
表达矩阵（Filtered Feature-Barcode Matrix）：一个巨大的表格，行是基因，列是细胞，中间的数字是UMI计数。这是后续所有分析的起点。
BAM文件：比对文件，可用于可视化验证。
Web Summary HTML：包含细胞数、测序饱和度、比对率等关键质控指标。
第三阶段：高级分析（数据挖掘）
拿到表达矩阵后，接下来的分析通常使用 R语言 + Seurat包 或 Python + Scanpy包 进行。这是单细胞分析最有趣的部分。
1. 数据质控与过滤
并不是所有检测到的“细胞”都是好细胞。
过滤标准：
线粒体基因比例过高（通常 > 10-20%）：表明细胞质膜破裂，细胞正在死亡或已死亡。
检测到的基因数过少：可能是空液滴或死细胞。
检测到的基因数过多：可能是一个液滴包裹了两个细胞（双细胞或多细胞）。
软件：Seurat / Scanpy。
2. 数据标准化与归一化
目的：消除测序深度（即每个细胞测到的总UMI数不同）带来的技术误差。
方法：将每个细胞的UMI计数除以该细胞的总UMI数，再乘以缩放因子（如10,000），最后进行对数转换（LogTransform）。
3. 特征选择与降维
高变基因筛选：找出在细胞间表达差异最大的基因（这些基因定义了细胞的身份）。
主成分分析：将数千个基因的信息压缩成几十个主成分，去除噪音。
非线性降维：
t-SNE / UMAP：将高维数据投射到二维平面，以便可视化。
4. 细胞聚类
目的：让计算机根据基因表达谱的相似性，自动将细胞分群。
结果：每个细胞被分配一个“簇”ID（如Cluster 0, Cluster 1...），通常认为每个簇代表一种细胞类型或状态。
5. 差异表达分析与细胞类型注释
找标记基因：找出每个簇（Cluster）相对于其他簇高表达的基因（如Cluster 0高表达CD3D，Cluster 1高表达CD79A）。
人工注释：根据标记基因，结合生物学知识，给每个簇命名（如 Cluster 0 = T细胞，Cluster 1 = B细胞）。
辅助工具：SingleR（自动注释）、CellMarker数据库。
6. 下游高级分析（根据研究目的定制）
轨迹推断/拟时序分析：
目的：研究细胞动态变化过程，如T细胞分化、肿瘤演进。
软件：Monocle 3、Slingshot。
原理：既然无法追踪同一个细胞在不同时间点的变化，就假设细胞处于不同的成熟阶段，将它们按基因表达的相似性排列成一条“轨迹”。
细胞通讯分析：
目的：研究不同细胞类型之间如何通过配体-受体对进行交流。
转录因子调控网络：
目的：找出驱动细胞状态转变的核心转录因子。
差异丰度分析：
目的：比较疾病组与对照组中，某种细胞类型的比例是否发生显著变化。
单细胞 vs 普通转录组流程对比
需要留意的关键点
稀疏性：单细胞数据非常稀疏，通常有90%以上的基因表达量为0，这是正常的（因为每个细胞内的mRNA本来就很少）。
批次效应：不同时间、不同人做的实验，技术误差可能比生物学差异还大，需要用 Harmony 或 Seurat IntegrateData 等方法进行校正。
计算资源：处理几万个细胞的数据，通常需要较大的内存（32GB以上可能不够），必要时需要使用云服务器。
目标
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素材 | 智普肽德
文案 | 智普肽德
图片 | 智普肽德