胆汁酸代谢和抗肿瘤免疫在肝癌进展过程中均受到破坏。然而，两者之间复杂的调控关系仍不清楚。在此，作者发现醛酮还原酶1D1（AKR1D1）的缺失通过肠道菌群失调促进异胆酸（Iso-LCA）的积累，从而削弱自然杀伤（NK）细胞的细胞毒性功能，导致肝细胞癌（HCC）的加速发展。机制上，AKR1D1的缺失导致卵形拟杆菌（Bacteroides ovatus，B. ovatus）比例增加，这种细菌可将胆酸（CDCA）分解为Iso-LCA。此外，积累的Iso-LCA以磷酸化cAMP反应元件结合蛋白1（p-CREB1）依赖的方式削弱肝脏NK细胞的抗肿瘤活性。保钾利尿剂螺内酯治疗通过靶向Iso-LCA介导的肿瘤免疫逃逸，显著增强了抗PD-1抗体对HCC进展的抑制作用。综上所述，作者的研究揭示了AKR1D1与HCC之间此前未被充分认识的联系，并提示靶向B. ovatus产生的Iso-LCA可能是激活NK细胞细胞毒性以治疗HCC的有前景的策略。
1、 AKR1D1的缺失会促进肝癌的进展
通过检测肝癌病变组织及其配对的邻近非癌组织中负责肝脏初级胆汁酸代谢的重要基因，作者首先发现 AKR1D1 在肿瘤组织中表达下调，而 CYP7A1 表达上调，而其他基因则保持不变。接下来，作者建立了二乙基亚硝胺（DEN）诱导的肝细胞癌（HCC）小鼠模型，并观察到与野生型（WT）小鼠相比，AKR1D1基因敲除（AKR1D1KO）小鼠的肝细胞癌发病率显著增加，肿瘤生长也更为明显（图1B）。与非癌组织相比，肝癌组织中AKR1D1蛋白水平显著降低（图1G）。同样地，作者发现肝癌患者的肿瘤组织中 AKR1D1mRNA 水平较低，并且 AKR1D1水平较高与肝细胞癌（HCC）患者的生存获益相关（图1I）。
图1. AKR1D1的缺失促进了肝癌的进展
2、 AKR1D1的缺失削弱了NK细胞的抗肿瘤效应。
RNA测序结果显示，有347个基因受到AKR1D1的调控（图2A）。进一步对这347个失调基因进行GO术语富集分析显示，在12个显著变化的GO术语中，有3个与免疫反应通路相关，包括炎症反应、细胞因子-细胞因子受体相互作用以及NK细胞介导的细胞毒性正向调控（涉及Crtam、Cd226、Klrd1和Slamf6），这表明肝脏中的AKR1D1可能通过干扰免疫细胞的功能来抑制肝细胞癌（HCC）的发生（图2B）。与野生型（WT）组相比，Akr1d1缺失导致肝脏中NK细胞的比例显著减少，而CD8⁺ T细胞的比例增加（图2C和2D）。选择性地耗竭NK细胞加速了肝细胞癌（HCC）的进展，并消除了野生型（WT）和AKR1D1基因敲除（AKR1D1KO）小鼠之间肝脏肿瘤负荷的差异（图2I）。
图2. AKR1D1的缺失削弱了自然杀伤细胞的抗肿瘤效应
3、Iso-LCA通过依赖CREB1的方式参与了AKR1D1介导的对NK细胞细胞毒性的抑制。
采用液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）技术对二乙基亚硝胺（DEN）诱导的肝细胞癌（HCC）小鼠肝脏组织中的代谢物进行靶向代谢组学分析显示，与野生型（WT）组相比，Akr1d1基因敲除（KO）小鼠的胆汁酸组成发生了变化（图3A）。特别是，作者观察到几种次级胆汁酸的水平增加，包括脱氧胆酸（apocholic CA，apoCA）、别胆酸（allocholic acid，alloCA）、3β-熊去氧胆酸（3β-ursodeoxycholic acid，3β-UDCA）、异胆酸（iso-LCA）、脱氢胆酸（dehydroLCA）和胆酸（LCA）（图3B、3C）。其中，异胆酸（iso-LCA）处理最显著地抑制了NK细胞分泌IFN-γ和TNF-α（图3D）。
图3. Iso-LCA通过CREB1依赖的方式参与AKR1D1介导的对自然杀伤细胞细胞毒性的抑制
4、B. ovatus（卵形拟杆菌）促进了iso-LCA（异胆酸）的产生，而iso-LCA会减弱NK细胞的细胞毒性。
与野生型（WT）样本相比，AKR1D1基因敲除（AKR1D1KO）小鼠的肠道菌群组成存在显著差异，其在门水平上的肠道菌群库发生了显著变化（图4A）。作者观察到在AKR1D1KO小鼠的肠道微生物组组成中，门水平上从厚壁菌门（Firmicutes）向拟杆菌门（Bacteroidetes）发生了显著的转变（图4B）。抗生素（ABX）处理增强了AKR1D1基因敲除（AKR1D1KO）小鼠中NK细胞分泌IFN-γ的能力（图4E）。这些提示由AKR1D1缺失引起的肠道菌群失调（dysbiosis）会促进NK细胞功能障碍以及肝细胞癌（HCC）中的免疫逃逸。B. ovatus（卵形拟杆菌）的比例与几种次级胆汁酸的水平呈正相关，这些胆汁酸在AKR1D1基因敲除（AKR1D1KO）小鼠的肝脏组织和血清中均有所增加（包括iso-LCA、apoCA和alloCA）（图4F）。与对照组相比，作者发现肝癌患者的血清中 **AKR1D1** 的表达水平显著降低，而血清中 iso-LCA 的含量和粪便中 B. ovatus 的丰度均有所增加（图4G和4H）。此外，血清中 iso-LCA 的水平与粪便中 B. ovatus 的丰度呈正相关，而 AKR1D1 蛋白水平则与血清中 iso-LCA的丰度或粪便中 B. ovatus 的丰度呈负相关（图4I）。
图4. 在AKR1D1基因敲除小鼠和肝细胞癌样本中，卵形拟杆菌（B. ovatus）的丰度与Iso-LCA的增加呈相关性
5、B. ovatus（卵形拟杆菌）通过诱导iso-LCA（异胆酸）的积累来削弱NK细胞的抗肿瘤免疫功能，从而促进肝细胞癌（HCC）的进展。
为了确定 B. ovatus（卵形拟杆菌）调节NK细胞功能的机制，将 B. ovatus与初级胆汁酸 CDCA（胆酸）在厌氧条件下共同孵育48-72小时，并收集上清液用于液相色谱-质谱（LC-MS）分析。有趣的是，在厌氧培养的上清液中检测到了 iso-LCA（异胆酸）（图5A和5B）。与接受对照组（PBS）处理的野生型（WT）小鼠相比，B. ovatus（卵形拟杆菌）加速了肿瘤的进展，并且与乳酸菌处理相比，B. ovatus处理缩小了野生型（WT）和 AKR1D1 基因敲除（AKR1D1KO）小鼠之间肝脏肿瘤负荷的差异（图5D）。此外，在喂食 B. ovatus 后，小鼠粪便中的 iso-LCA（异胆酸）水平增加，而乳酸菌处理则没有这种效果（图5E）。
图5. 卵形拟杆菌（B. ovatus）促进Iso-LCA的生成，从而减弱自然杀伤细胞的细胞毒性
6、异胆酸（Iso-LCA）拮抗剂螺内酯（SPI）可增强抗PD-1抗体用于肝细胞癌（HCC）治疗的抗肿瘤效率。
Iso-LCA的结构与类固醇相似，通过在Drug Bank中筛选与iso-LCA结构相似的药物，作者选出了8种化合物（图6A）。为了确定最有效的化合物，作者将这8种化合物分别添加到含有iso-LCA的NK细胞培养基中进行体外实验。通过综合分析TNF-α和IFN-γ细胞因子的分泌情况，作者发现螺内酯（SPI）在恢复NK细胞的细胞毒性方面最为有效，这一结果通过流式细胞术得到了验证（图6A）。与接受对照处理的AKR1D1基因敲除（AKR1D1KO）小鼠相比，使用螺内酯（SPI）或抗PD-1抗体单独治疗的AKR1D1KO小鼠的肝脏肿瘤有所减少，但SPI与抗PD-1抗体的联合使用对肝细胞癌（HCC）进展具有显著的协同抑制作用（图6B）。同样，肿瘤浸润性NK细胞中的IFN-γ和TNF-α水平与治疗效果一致（图6C）。
图6. Iso-LCA拮抗剂SPI增强了抗PD-1抗体用于肝细胞癌（HCC）治疗的抗肿瘤效率
在本研究中，作者发现，AKR1D1在HCC中的水平显著降低，而AKR1D1的缺失会以自然杀伤（NK）细胞依赖的方式促进HCC的进展。代谢组学分析表明，AKR1D1的缺失导致胆汁酸的肝肠循环中断，并伴随着肠道菌群的变化。从机制上讲，作者发现AKR1D1基因敲除（AKR1D1KO）小鼠肝脏中次级胆汁酸异胆酸（iso-LCA）的水平显著增加，iso-LCA通过依赖磷酸化CREB1（p-CREB1）的方式抑制NK细胞的细胞毒性。此外，iso-LCA水平的增加归因于AKR1D1KO小鼠肠道微生物中拟杆菌属卵形拟杆菌（B. ovatus）比例的增加，导致初级胆汁酸胆酸（CDCA）被分解为iso-LCA。重要的是，作者证明了使用保钾利尿剂螺内酯（SPI）治疗可以部分缓解iso-LCA介导的NK细胞抗肿瘤免疫抑制。有趣的是，与健康个体相比，作者发现肝癌患者的血清中AKR1D1的表达水平显著降低，而血清中iso-LCA的含量和粪便中B. ovatus的丰度则增加。此外，血清中iso-LCA的水平与B. ovatus的丰度呈正相关，而AKR1D1蛋白水平与血清中iso-LCA的丰度或粪便中B. ovatus的丰度呈负相关。总之，本研究结果强调了AKR1D1在调节肠道菌群 - 胆汁酸轴中的作用，这有助于HCC中NK细胞功能障碍的发生，并为靶向NK细胞功能以改善HCC治疗效果提供了潜在策略。
图7 AKR1D1的缺失通过增加肝脏中iso-LCA（异胆酸）的水平来削弱NK细胞的细胞毒性。
参考文献：
Wei H, Suo C, Gu X et al. AKR1D1 suppresses liver cancer progression by promoting bile acid metabolism-mediated NK cell cytotoxicity. Cell Metab. 2025, Feb 19:S1550-4131(25)00011-7.
