免疫检查点阻断（ICB）疗法彻底改变了癌症治疗，但目前仅对部分患者有效。越来越多的证据表明，肠道微生物群及其代谢产物对ICB疗法的疗效起着关键作用。在本研究中，作者对165名接受抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）治疗的患者的粪便微生物群和代谢组进行了多组学分析，识别出与治疗反应相关的微生物和代谢特征。通过整合四个公共宏基因组数据集（样本量为568）的数据，作者发现了跨队列的微生物和代谢标志物，并在一个独立队列（样本量为138）中进行了验证。一个整合了这些特征的预测模型表现出稳健的性能。值得注意的是，作者表征了五种与反应相关的肠型，每种肠型都与特定的细菌分类群和代谢产物相关联。其中，代谢产物苯乙酰谷氨酰胺（PAGln）与反应呈负相关，并在体内显示出削弱抗PD-1疗效的作用。本研究揭示了肠道微生物群、肠道代谢组与免疫治疗反应之间的相互作用，并识别出潜在的生物标志物，以改善治疗结果。
1、整合内部和外部队列以分析抗PD-1/PD-L1治疗反应
共收集了303名接受抗PD-1/PD-L1治疗的患者，包括内部队列1（n = 165）和队列2（n = 138）。粪便样本用于宏基因组测序和代谢组学分析。在队列1中进行了差异分析，并将改变的肠道微生物组和代谢物进一步用于相关性分析。基于随机森林（RF）算法，创建了包括宏基因组学、代谢组学和综合多组学的预测模型。具体而言，通过整合四个公共抗PD-1/PD-L1队列与队列1，构建了宏基因组学模型，并在队列2中对这些预测模型进行了验证。
图1. 本研究概览示意图
2、 与抗PD-1/PD-L1治疗反应相关的独特微生物和代谢特征
作者发现在物种水平上，应答者（Rs）和无应答者（NRs）之间β多样性存在统计学差异（图2A和2B）。这种差异表明与治疗反应相关的某种程度的组成变化，这一结论通过在门和物种水平上考虑临床因素，使用多变量逻辑回归进行差异丰度分析得到支持。在属水平上，作者发现了11个与治疗反应呈正相关的属，例如丁酸弧菌属（Butyricicoccus）等，而有7个属与治疗反应呈负相关，包括克雷伯菌属（Klebsiella）等。在物种水平上，分析显示有74种细菌与治疗反应相关，其中20种可能有助于促进反应，在与反应呈负相关的物种中，作者发现了两种属于克雷伯菌属的细菌，包括肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和密歇根/产气克雷伯菌（Klebsiella michiganensis/oxytoca）（图2C）。
代谢物组学分析突显了这些组别之间的显著差异（图2D）。揭示了16种与反应呈正相关的代谢物，例如D-核糖、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、3-氨基-4-羟基苯甲酸和蛋氨酸亚砜胺，而五种代谢物，包括戊二酰肉碱、4-乙酰氨基丁酸、麦芽三糖、嘌呤和苯乙酰谷氨酰胺（PAGln），与反应呈负相关（图2E）。
此外，作者通过考虑抗生素使用的影响，对这些改变的细菌和代谢物进行了偏相关性分析，揭示了在应答者（Rs）中增加的细菌与代谢物之间存在普遍的正相关关系，而在无应答者（NRs）中富集的细菌与在应答者中富集的代谢物之间存在负相关关系（图2F）。这些关联表明，肠道微生物群介导的对免疫治疗的增强反应可能依赖于细菌群落或其共有代谢物的共同作用，而不是依赖于单一的细菌或代谢物。
图2. 队列1中应答者（Rs）与无应答者（NRs）的肠道微生物组和代谢物的变化
3、 多组学标志物预测抗PD-1/PD-L1治疗反应
在本研究中，作者旨在评估整合细菌和代谢组学数据是否能进一步提升预测性能，相较于仅使用细菌数据。为此，作者将四个已发表的抗PD-1治疗队列的数据与作者内部队列1的数据相结合，总共纳入了733个样本。
作者利用这一核心的最佳特征集开发了一个稳健的随机森林（RF）模型（图3A）。核心细菌特征集包含17个分类群，这些分类群是从差异丰度物种（被视为生物标志物）中通过迭代特征消除（IFE）方法筛选出来的，用于反应预测的曲线下面积（AUC）达到了0.79（图3B）。具体而言，在这些核心特征中，有11个物种在应答者（Rs）中富集，而6个物种在无应答者（NRs）中增加。
随后，作者试图探究基于粪便代谢物的模型是否能够有效预测患者的治疗反应。采用与细菌分析相同的策略，作者将其应用于队列1中识别出的差异代谢物（图2E）。这种方法导致了选择出一组具有最高预测能力的核心9种代谢物（图3D）。训练队列在区分应答者（Rs）和无应答者（NRs）方面表现出0.80的曲线下面积（AUC）（图3E）。作者在队列2中验证了该预测模型，达到了0.79的AUC（图3F）。
此外，作者还评估了整合细菌和代谢物的模型是否能够提升预测能力。采用类似的方法，作者识别出一个包含12种细菌和3种代谢物的核心特征集，共15个特征（图3G）。这一整合模型在队列1中表现出更高的曲线下面积（AUC），达到0.87，并在队列2中独立验证，AUC达到0.88（图3H和3I）。这些发现强调了细菌和粪便代谢物在预测免疫治疗反应中的潜在贡献。
图3. 核心特征与预测模型的准确性
4、与抗PD-1/PD-L1治疗反应及预后相关的肠型
作者的分析显示，733个样本形成了5个具有显著不同α多样性（Shannon指数）的独立簇（即肠型）（图4A和4B）。随后的差异分析揭示了特定属的丰度变化，这些属分别特征化了这五种肠型：瘤胃球菌属（肠型1，E_Rumin）、大肠杆菌属（肠型2，E_Esch）、拟杆菌属（肠型3，E_Bact）、梭菌属（肠型4，E_Clos）和普雷沃菌属（肠型5，E_Prev）。有趣的是，当与抗PD-1治疗相关的表型联系起来时，作者发现E_Rumin（瘤胃球菌肠型）和E_Bact（拟杆菌肠型）是两种应答者（Rs）比例较高的肠型，并且这些肠型的患者相较于其他肠型的患者，也表现出显著更长的无进展生存期（PFS）（图4I–4K、S4D和S4E）。
这些发现表明，在接受抗PD-1治疗的患者中识别肠型的重要性，提示患者的固有肠型（不受粪菌移植[FMT]等干预措施的影响）可能会决定其对抗PD-1治疗的反应。在此基础上，结合先前的研究证据表明，特定肠型来源的粪菌移植可以通过改变肠道微生物群和肿瘤微环境来增强抗PD-1治疗的疗效，作者进一步探索了通过粪菌移植人为诱导的肠型是否也与治疗反应性相关。为了深入研究，作者利用作者建立的荷瘤小鼠队列，将它们分为接受来自不同供体的粪菌移植的组别。利用基于肠道微生物群组成的分区围绕中位数（PAM）分类器，类似于作者之前的方法，作者为每只小鼠分配了肠型（图4L，上）。鉴于E_Rumin和E_Bact肠型与更高的反应率和更长的无进展生存期（PFS）相关，作者通过简化分析，将样本分为E_Rumin/E_Bact或E_Others。值得注意的是，相当一部分被预测为E_Rumin/E_Bact的小鼠属于对抗PD-1治疗更敏感的组（图4L，左下）。为了在临床环境中验证这些结果，作者收集了来自两个黑色素瘤队列的数据，其中对抗PD-1治疗无效的患者在接受抗PD-1治疗前接受了来自应答者（Rs）的粪菌移植。结果一致显示，被预测为E_Rumin/E_Bact的患者比被预测为E_Others的患者表现出显著更高的反应率（图4L，右下）。
综上所述，这些发现表明，肠型可能作为一种预测抗PD-1治疗反应性的指标，无论其是处于自然状态还是通过粪菌移植（FMT）进行了改变。尤为重要的是，对于对抗PD-1治疗产生耐药性的患者，粪菌移植作为一种重塑肠道微生物群的策略，使其肠道微生物群向更有利于抗PD-1治疗的肠型（例如E_Rumin/E_Bact）转变，从而有可能恢复其对抗PD-1治疗的反应性。
图4. 通过整合宏基因组学数据识别肠型
5、 不同肠型中的微生物功能模块和代谢模式
为了研究不同肠型中微生物群落变化的功能意义，作者使用KEGG同源物（KO）谱从京都基因与基因组百科全书（KEGG）（n = 537）中注释功能模块。随后，作者通过与其他肠型进行比较，识别出每个肠型的差异丰度模块（图5A；表S4）。作者发现，E_Rumin（瘤胃球菌肠型）富含氨酰-tRNA、苏氨酸、三酰甘油和海藻糖的生物合成，以及硫酸盐、生物素和潜在极性氨基酸的运输；E_Bact（拟杆菌肠型）富含四氢叶酸、泛酸、吡哆醛和异亮氨酸的生物合成，组氨酸和亮氨酸的降解，以及葡萄糖醛酸和糖醛酸的代谢；E_Clos（梭菌肠型）主要由甲烷生成和古菌相关的RNA聚合酶、DNA聚合酶II复合体和外泌体主导；E_Esch（大肠杆菌肠型）富含多种化学物质（如腐胺、谷胱甘肽和牛磺酸）的运输过程，以及酸和药物耐受性及抗菌肽抗性；E_Prev（普雷沃菌肠型）富含许多复合体相关模块，其中以Skp1-Cullin-F-box（SCF）复合体为代表，与E3泛素连接酶相关，表明E_Prev中蛋白质降解过程高度活跃。
为了阐明肠型与宿主代谢之间的潜在联系，作者在内部队列1中比较了不同肠型的独特代谢模式（图5B）。作者的分析显示，E_Rumin（瘤胃球菌肠型）表现出较高的苯胺-2-磺酸、天冬氨酸、牛磺酸以及核苷酸及其类似物（包括胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶和脱氧胞嘧啶）浓度。值得注意的是，天冬氨酸已被发现可以激活CD8+ T细胞，并通过增强淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶信号传导来增强抗肿瘤反应。此外，牛磺酸在调节肠道微生物群和促进肠道稳态恢复方面发挥积极作用。牛磺酸已被证明可以通过刺激磷脂酶Cγ1介导的钙信号和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导，增强T细胞增殖，并提高抗PD-1治疗的抗肿瘤效果。
此外，E_Prev（普雷沃菌肠型）显示出纤维二糖、S-腺苷甲硫氨酸和肌肽浓度的增加。而E_Esch（大肠杆菌肠型）则表现出苯乙酰谷氨酰胺（PAGln）和4-乙酰氨基丁酸浓度的升高。E_Esch和E_Prev两种肠型均表现出γ-氨基丁酸（GABA）和嘌呤水平的升高。GABA被认为可以通过诱导M2型巨噬细胞极化，并通过β-连环蛋白信号传导抑制CD8+ T细胞的浸润，从而促进肿瘤生长。PAGln是一种肠道微生物来源的代谢物，与致命前列腺癌和心血管疾病风险增加有关。有趣的是，富集于E_Esch的肺炎克雷伯菌已被证明可以通过一种与proA基因无关的方式产生PAGln。
此外，E_Bact（拟杆菌肠型）富含核糖酸和草酸。E_Clos（梭菌肠型）表现出多种有机酸及其衍生物（如脯氨酸和氨基己二酸）浓度的升高，以及胆汁酸——异胆酸（isoLCA）浓度的增加。值得注意的是，isoLCA已被证明可以通过产生线粒体活性氧来抑制辅助性T细胞（Th17）的分化，并增加调节性T细胞（Treg）的分化。
图5. 不同肠型的功能和代谢变化
6、 肠型中微生物组与代谢物相互作用的生物学关系
作者假设肠道细菌能够产生或代谢影响患者生物过程的化合物，从而导致免疫微环境的变化以及对抗PD-1治疗的不同反应。通常，微生物组与代谢物之间的生物学联系是通过特定基因介导的，这些基因编码催化代谢物反应的酶，并伴随着相应途径（即KEGG模块）的改变。这可能有助于解释特定肠型中某种代谢物的富集现象。为了探索每个肠型内的潜在联系，作者进一步识别了每个肠型相对于其他肠型的独特差异KO基因。作者将每个肠型中差异丰度的代谢物作为线索，手动筛选这些代谢物参与的显著增加的KEGG模块。随后，作者识别了属于这些KEGG模块的上调KO基因。这种方法使作者能够构建由KO基因和相关途径介导的微生物组与代谢物之间的潜在生物学联系。
在这些观察到的联系中，作者注意到在E_Rumin（瘤胃球菌肠型）中，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢（map00250）和组氨酸代谢（map00340）高度活跃，从而导致天冬氨酸的产生（图6A，左侧）。除了这些途径外，作者还识别出11个在E_Rumin中显著上调的KO基因，它们由9种细菌编码。重要的是，这些细菌中的大多数也在E_Rumin中显著富集，包括阿氏菌（Adlercreutzia equolifaciens）、厌氧菌（Anaerostipes hadrus）、普氏粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）、肠道玫瑰菌（Roseburia intestinalis）、瘤胃球菌（Ruminococcus bromii）和乳酸瘤胃球菌（Ruminococcus lactaris）（图6A，右侧）。
类似地，在E_Esch（大肠杆菌肠型）中，作者发现苯丙氨酸代谢（map00360）、谷氨酸代谢（map00250）和GABA分流（M00027）被激活，表明该肠型中苯乙酰谷氨酰胺（PAGln）和GABA的产生（图6B）。总共有7个KO基因参与了PAGln的产生，主要由5种在E_Esch中富集的细菌贡献，包括大肠杆菌（Escherichia coli）、克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae、Klebsiella oxytoca）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）和摩根菌（Morganella morganii）。此外，E_Esch中GABA产生模块涉及的4个KO基因也主要由大肠杆菌和肺炎克雷伯菌贡献，这表明它们在驱动E_Esch的代谢表型中可能发挥潜在作用。
有趣的是，作者在E_Clos（梭菌肠型）中观察到与甲烷生成相关的上调途径，包括M00356和M00567，伴随着14个与这些过程相关的KO基因的增加（图6C）。值得注意的是，E_Clos主要由一种古菌——史密斯甲烷短杆菌（Methanobrevibacter smithii）主导，其对这些KO基因的上调贡献显著。此外，E_Clos中黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的增加可能通过核黄素代谢（map00740）过程实现，涉及7个上调的KO基因。这些KO基因也由在E_Clos中富集的细菌贡献，例如史密斯甲烷短杆菌和肠道臭杆菌（Odoribacter splanchnicus）。这些结果阐明了各个肠型的代谢表型，这些表型归因于它们的主导细菌及其潜在产生的代谢物。
图6. 单个肠型中微生物组与代谢物的生物学联系
7、PAGln对免疫治疗效果的体内验证
作者想探究PAGln是否会降低体内抗PD-1治疗效果。对肿瘤小鼠分别进行抗 PD-1治疗及抗PD-1联合PAGln注射治疗。结果显示，联合PAGln治疗的小鼠，其肿瘤体积与重量显著增加，且血清中PAGln浓度更高（图7A-D）。与抗PD-1治疗组相比，联合治疗组小鼠有效CD8+T细胞比例更低、耗竭 CD8+T细胞比率更高，免疫刺激反应下降，CD8+ T细胞浸润减少（图7E- M）。该实验证明PAGln在免疫治疗中存在潜在不利影响。
图7. PAGln体内实验验证
这项研究不仅阐明了肠道微生物组与代谢组在调节ICB治疗反应中的关键作用，还为开发新型生物标志物和治疗策略奠定了科学基础，从而有望显著提升ICB治疗的疗效，并推动个体化医疗的发展。同时，基于对肠道微生物组、肠道代谢组和免疫治疗反应之间相互作用的深刻理解，肠道菌群移植可能作为潜在治疗策略。对于对抗PD-1单抗治疗产生抗药性的患者，肠道菌群移植有望重塑其肠道微生物群，促使肠型向更利于免疫治疗反应的方向转变，为这部分耐药患者带来新的治疗希望。
参考文献
Zhu X, Hu M, Huang X et al. Interplay between gut microbial communities and metabolites modulates pan-cancer immunotherapy responses. Cell Metab . 2025 Jan 28:S1550-4131 (24)00495-9.
