奇辉观点
减肥手术，如袖状胃切除术（SG），为人类患者提供了有效的2型糖尿病（T2D）缓解。研究表明，在小鼠和人类中，SG后胃肠道中的细菌代谢产物石胆酸（LCA）水平下降。在本研究中，作者展示了LCA恶化了葡萄糖耐量并损害了全身代谢。同时，作者还展示了牛磺脱氧胆酸（TDCA），唯一一种在小鼠小肠中SG后浓度增加的胆汁酸，它在体外和体内抑制了细菌胆汁酸诱导（bai）操纵子和LCA的产生。用TDCA治疗饮食诱导的肥胖小鼠降低了LCA水平，并导致依赖微生物群的葡萄糖处理改善。此外，T2D患者小肠组织中的TDCA丰度下降。这项工作揭示了TDCA是LCA产生的内源性抑制剂，并表明TDCA可能有助于减肥手术的血糖调节效应。因此，本研究揭示了减肥手术后改善代谢健康的潜在分子机制，特别是通过胆汁酸和肠道微生物组之间的相互作用。此外，这项研究为开发新的治疗T2D和相关代谢疾病的策略提供了可能的靶点，例如通过调节胆汁酸水平或利用胆汁酸类似物来改善代谢健康；强调了肠道微生物组在代谢调节中的重要性，并为未来的个性化医疗和精准治疗提供了科学依据。
论文ID
本文译自：Chen Y, Chaudhari S, Harris D et al. A small intestinal bile acid modulates the gut microbiome to improve host metabolic phenotypes following bariatric surgery. Cell Host Microbe. 2024 Aug 14; 32(8): 1315-1330.e5. doi: 10.1016/j.chom.2024.06.014.
发表杂志：Cell Host Microbe
影响因子：22
通讯作者：A. Sloan Devlin
作者单位：Harvard Medical School
引 言
2型糖尿病（T2D）是一种以高血糖为特征的慢性疾病。这种情况是导致失明、肢体丧失和肾衰竭的主要原因，每年造成超过100万人死亡。T2D与肥胖密切相关，因此，全球T2D的患病率以惊人的速度持续上升，这就需要开发新的战略来对抗这种疾病。减肥手术是治疗T2D和肥胖最有效和持久的医疗手段。尽管其他T2D治疗的目标是控制血糖，但减肥手术不仅改善了血糖控制，还逆转了潜在的胰岛素抵抗，导致许多患者的T2D缓解。尽管如此有效，但由于获取手术的障碍以及对手术侵入性和风险的担忧，只有1%的符合条件的患者接受减肥手术。目前尚不清楚减肥手术在分子水平上如何改善葡萄糖不耐受，这是将手术的好处更广泛地提供给T2D患者的一个关键障碍。
袖状胃切除术（SG）是当今最常见的减肥手术，涉及胃大弯的外科切除。患者和动物模型的证据表明，手术后葡萄糖不耐受的解决可以独立于体重减轻。手术后几小时到几天内高血糖得到解决，而体重减轻在手术后一年达到最大。此外，在瘦小鼠上进行SG手术，即使体重、体成分和食物摄入量与假手术对照组相同，也能改善葡萄糖处理。这些观察结果表明，与体重无关的机制有助于减肥手术后葡萄糖改善。
近期研究已经确定胆汁酸（BAs）是重要的生化因素，它们与减肥手术后改善的葡萄糖调节有关，并且有因果联系。在患者中，循环中的总胆汁酸和结合胆汁酸水平在手术后迅速增加并保持高水平，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者观察到更大的增加。与循环中的BAs相比，减肥手术后肠道BAs的变化研究不足。肠道BAs的变化可以影响法尼醇X受体（FXR）信号传导，导致成纤维细胞生长因子19（FGF19，小鼠中的FGF15）的上调，进而降低血糖。肠道BAs还可以激活肠道中的G蛋白偶联胆汁酸受体1（GPBAR1或武田G蛋白偶联受体5，TGR5），以刺激胰高血糖素样肽1（GLP-1）的分泌，从而诱导胰腺分泌胰岛素。通过分析肠道BAs，我们之前发现肠道限制性BA代谢产物胆酸-7-硫酸盐（CA7S）在小鼠盲肠和人类粪便中SG后增加。我们发现CA7S激活TGR5，刺激GLP-1分泌，并改善饮食诱导的肥胖（DIO）小鼠的葡萄糖耐量，从而提供了SG导致糖尿病表型改善的一种机制。
然而，关于BAs在减肥手术有益的代谢效应中扮演的角色，仍有许多未解之谜。例如，在先前的研究中，我们发现在SG后小鼠盲肠内容物和人类粪便中石胆酸（LCA）的水平显著降低。其他研究也观察到减肥手术后次级BAs水平的降低。LCA是一种次级BA，通过人类肠道细菌含有BA诱导（bai）操纵子的细菌，包括梭状芽孢杆菌和密切相关的细菌，对初级宿主产生的BA鹅去氧胆酸（CDCA）进行7α-脱羟基作用产生。大多数肠道LCA因在水中溶解度低而分泌在粪便中，而少量通过肠肝循环从肠上皮运输到肝脏。我们发现，胃肠道（GI）中LCA水平的降低驱动了一条肠-肝信号通路，导致通过门静脉将LCA运输到肝脏的增加，LCA在肝脏激活维生素D受体（VDR），并合成血糖调节BA CA7S。这些数据表明，LCA水平的降低间接有利于宿主的葡萄糖调节。LCA是一种已知的致癌物质，在动物模型中促进结肠和肝癌，并与患者的结直肠癌高度相关。然而，LCA本身是否对宿主产生直接的代谢效应尚不清楚。先前的研究表明，LCA在TGR5过表达小鼠的培养回肠外植体中诱导GLP-1分泌。然而，LCA并未在野生型小鼠的回肠外植体中诱导GLP-1分泌，且未进行体内实验。在其他工作中，腹腔注射LCA导致体重减轻，并伴随结肠长度缩短，与PBS对照组相比，表明LCA产生了毒性效应。最后，直肠给药LCA在啮齿动物结肠炎模型中发挥了抗炎效应。然而，由于这些动物在LCA给药前就表现出结肠炎症状，LCA在稳态条件下对代谢的影响仍然未知。
在这里，我们展示了在非肝毒性浓度下，LCA通过扰乱血糖和增加脂肪而不影响总体重来影响宿主代谢。此外，我们探索了SG后GI LCA水平下降的起源。由于小肠（SI）位于手术部位的直接远端，我们假设SG后SI内容物中的因素抑制了结肠细菌产生LCA。事实上，我们发现过滤后的SI内容物和来自SG后小鼠的有机提取物都抑制了LCA的产生。然后，我们发现牛磺脱氧胆酸（TDCA）是唯一一种在小鼠SI中SG后浓度增加的BA。我们证明了TDCA抑制了bai操纵子的表达，并在不影响细菌生长的情况下抑制了结肠细菌产生LCA。我们还展示了慢性TDCA治疗以微生物群依赖的方式保护肥胖小鼠免受血糖失调的影响。我们观察到TDCA水平在糖尿病人SI组织中降低，进一步表明TDCA作为一种糖调节代谢物的功能。这项工作将TDCA识别为bai操纵子和LCA产生的小分子抑制剂。此外，这些研究揭示了SG有益地改变宿主代谢的机制，并为TDCA作为LCA诱导的血糖失调治疗的发展铺平了道路。
结 果
LCA处理增加宿主的葡萄糖不耐受和脂肪堆积
为了研究肠道LCA水平的增加是否对宿主代谢产生不利影响，我们将0.03%（重量/重量）的LCA添加到C57BL/6J小鼠的正常饲料中，喂养6周。由于LCA具有肝毒性，我们建立了一个长期喂养模型，使我们能够在不引起肝毒性的情况下探索LCA的代谢效应（图1A和S1A-S1C）。LCA喂养导致盲肠和结肠中这种代谢物的显著积累（图1B）。重要的是，对照组小鼠盲肠中的LCA含量与高脂饮食（HFD）的SG小鼠观察到的水平相似（平均35 pmol/mg湿重，大约相当于35 mM），而0.03% LCA喂养组的盲肠LCA水平（平均115 pmol/mg湿重）则模仿了先前观察到的假手术对照组盲肠LCA水平（平均80 pmol/mg湿重）。此外，对照组和0.03% LCA喂养小鼠的LCA浓度均在人类盲肠内容物中报告的浓度范围内（4-275 mM，平均160 mM）。血清和肝脏中的LCA水平在对照组和0.03% LCA喂养组中均低于检测限。异胆酸（isoLCA，一种LCA衍生的代谢物）、牛磺熊脱氧胆酸（TUDCA）和α-穆里希胆酸（aMCA）在盲肠内容物中的水平显著增加，而iso-LCA和3-oxoLCA在结肠中的水平显著增加（图S1D和S1E）。小鼠肝脏重新羟化并结合次级BAs，包括LCA，这可能解释了TUDCA和aMCA在盲肠中的水平增加以及LCA喂养小鼠血清和肝脏中LCA水平低的原因。门静脉BAs水平在各组之间没有显著差异（图S1F）。然而，可能由于最终LCA剂量和安乐死之间已经过去了12-16小时（见STAR方法），因此未观察到LCA诱导的门静脉BAs浓度变化。
LCA喂养导致的能量消耗和呼吸交换比率（RER）与对照组小鼠相比有所下降，这是通过综合实验室动物监测系统（CLAMS）确定的。食物消耗和活动保持不变（图1C；表S1）。LCA处理后RER的下降与我们先前的观察一致，即显示较低盲肠LCA的SG小鼠与假手术小鼠相比，表现出更高的RER。SG后RER的增加表明优先利用葡萄糖，并反映了有助于长期血糖调节改善的代谢适应。引人注目的是，将SG小鼠的盲肠微生物群移植（CMT）到无菌（GF）小鼠中，与从假手术小鼠进行CMT相比，RER有所增加，这表明肠道微生物的变化有助于SG后RER的增加27。这里，我们证明了单独调节微生物代谢物LCA的水平就足以影响小鼠的RER，这表明LCA水平的降低有助于SG后增加葡萄糖的利用。
接下来，在LCA喂养6周后，我们对小鼠进行了口服葡萄糖耐量测试（OGTT）。与对照组相比，LCA喂养组显示出明显的葡萄糖清除受损（图1D），并且通过胰岛素抵抗的稳态模型评估（HOMA-IR）确定的胰岛素抵抗增加（图1E）。LCA喂养导致白色脂肪组织重量（WATs）增加，包括腹股沟、性腺、肠系膜和肾周WATs，而总体重与对照组相比没有变化（图1F）。这些结果与先前的观察一致，即携带较高盲肠LCA的假手术小鼠比SG小鼠更不耐葡萄糖，并且脂肪质量更高。综合这些数据，我们证明了LCA损害了宿主的葡萄糖调节和脂肪堆积，并提出了LCA水平在SG后降低可能有助于手术后减少葡萄糖不耐受的可能性。
图1. LCA处理增加宿主葡萄糖不耐受和脂肪堆积
(A) LCA喂养实验的示意图。小鼠被喂养正常饲料，加或不加0.03% LCA（重量/重量），持续6周。在第4周，小鼠被单独饲养在CLAMS笼中。在第6周进行OGTT。
(B) 盲肠和结肠中的LCA水平。
(C) LCA处理的小鼠表现出RER降低。
(D和E) LCA喂养通过OGTT（D）损害了葡萄糖调节，并增加了通过HOMA-IR（E）确定的胰岛素抵抗。
(F) LCA喂养增加了腹股沟（i）WAT、性腺（g）WAT、肠系膜（m）WAT和腹膜后（rp）WAT，而没有改变体重。
饮食诱导的肥胖（DIO）小鼠的小肠（SI）内容物支持盲肠LCA的产生
细菌产生LCA需要由大肠中苛养厌氧菌的bai操纵子编码的酶的作用。baiCD基因编码一种3-氧代/3-氧代-4,5-脱氢胆汁酸氧化还原酶，它在LCA生物合成级联反应中作为关键酶发挥作用。在SG后的小鼠中，盲肠baiCD基因表达降低。因此，我们试图确定SG如何导致下消化道LCA的减少，可能通过抑制bai操纵子。减肥手术导致小肠（SI）的重大生理和/或解剖学改变。通过减少胃容量，SG直接影响胃内容物的保留。食物在SI中的快速释放也诱导肠道中BAs的释放和GI激素的分泌，这两者都塑造了肠道微生物群。因此，我们假设SG后SI内容物中的因子改变盲肠和结肠肠道共生菌的LCA产生。
在一项探索性的初步实验中，我们测试了过滤后的SI内容物是否能在体外调节LCA水平。我们在没有添加外源性BA的Cullen-Haiser肠道（CHG）培养基中，将DIO小鼠的盲肠内容物与过滤后的SI内容物或PBS一起厌氧培养1天（图2A）。过滤后的DIO SI内容物维持了盲肠培养的LCA产生，导致与PBS对照组相比，LCA水平显著更高（图2B）。在DIO SI内容物存在的情况下，微生物baiCD基因表达显著增加（图2C）。这些结果表明，DIO SI内容物可以影响下消化道细菌的LCA产生。
SG手术后小肠（SI）内容物抑制盲肠培养中的LCA产生。
接下来，我们研究了来自SG小鼠的SI内容物是否影响LCA的产生。假手术和SG小鼠的SI内容物被厌氧过滤，并与DIO小鼠的盲肠内容物一起孵育（未添加外源性BA）（图2D）。与过滤后的假手术SI内容物相比，过滤后的SG SI内容物降低了盲肠培养中LCA的浓度（图2E）并减少了baiCD基因表达（图2F），这表明SG SI内容物抑制了盲肠培养中的LCA产生。
去氧胆酸（DCA）也是由bai操纵子产生的，这种情况下是通过鹅去氧胆酸（CDCA）的7α-脱羟基作用。在添加了氘代CDCA-d4和CA-d4的情况下，假手术和SG SI内容物被加入到DIO盲肠培养中（图2G）。SG SI内容物降低了baiCD基因表达（图2H），并且与假手术SI内容物相比，显著降低了CDCA-d4到LCA-d4的转化，而不影响DCA-d4的产生（图2I和2J）。这些结果表明，SG SI内容物抑制了bai操纵子表达和LCA产生，但不会影响DCA产生。有趣的是，与这些体外观察一致，虽然我们观察到SG小鼠盲肠和人类粪便中LCA水平的下降，但DCA水平在两组中均未改变。
接下来，我们比较了假手术和SG SI内容物对LCA和DCA产生的影响与来自饮食诱导肥胖（DIO）和瘦小鼠SI内容物的影响（图2K）。未手术的DIO SI内容物诱导了LCA产生，而瘦小鼠SI内容物抑制了LCA产生。值得注意的是，未手术的DIO SI内容物诱导的LCA产生水平与假手术SI内容物相似，而SG SI内容物则模仿了瘦小鼠的结果（图2L）。在任何组中均未观察到DCA产生的差异（图2M）。总体而言，SI内容物诱导LCA产生与肥胖相关，而瘦小鼠和SG小鼠拥有抑制盲肠LCA产生的SI内容物。
图2. SG后小肠（SI）内容物抑制盲肠培养中的LCA产生
(A-C) DIO小鼠SI内容物中的因子促进LCA产生。
(D-F) 来自SG后和假手术后SI内容物的因子不同程度地影响LCA产生。
(G-J) 来自SG后SI内容物的因子减少从头合成的LCA产生，但不会影响DCA产生。
(K-M) 来自SG后SI内容物的因子将从头合成的LCA产生降低到与瘦小鼠SI内容物支持的水平相似，但不会影响DCA产生。
SG后小肠（SI）有机提取物抑制了梭状芽孢杆菌（C. scindens）中的LCA产生
在人类SG后的粪便样本中，我们观察到Clostridiales的丰度水平显著降低，这与之前的研究结果一致。为了确定SG SI内容物是否影响产生LCA的Clostridiales的生长，我们在CDCA存在的情况下，将梭状芽孢杆菌ATCC 35704（C. scindens ATCC）或C. scindens VPI 12708（C. scindens VPI）与假手术和SG SI内容物一起培养（图3A和S2A）。假手术和SG SI内容物均未对C. scindens的生长曲线产生任何变化（图3B和S2B）。然而，与我们在DIO盲肠培养中的结果一致，SG SI内容物抑制了C. scindens的LCA产生，并降低了baiCD基因表达（图3C, 3D, S2C和S2D）。此外，与假手术SI有机提取物相比，SG SI有机提取物抑制了C. scindens的LCA产生，并抑制了baiCD基因表达，而不影响细菌生长（图3E-3H和S2E-S2H）。最后，我们观察到SG SI有机提取物在不影响整体培养生长的情况下，抑制了盲肠培养中的LCA产生和baiCD基因表达（图3I-3L）。总的来说，这些结果表明SG SI内容物中存在可溶性有机因子，很可能是小分子，它们在不影响LCA产生微生物生长的情况下，抑制了C. scindens单培养和复杂盲肠细菌群落中的LCA产生。
图3. SG后小肠（SI）提取物抑制Clostridium scindens ATCC和盲肠培养中的LCA产生。
(A-D) 来自SG后SI内容物的因子抑制C. scindens ATCC的LCA产生。
(E-H) 来自SG后SI内容物的可溶性分子抑制C. scindens ATCC的LCA产生。
(I-K) 来自SG后SI内容物的可溶性分子抑制盲肠培养中的LCA产生。
SI中的牛磺脱氧胆酸（TDCA）抑制LCA产生。
胆汁酸（BAs）控制它们自己的生物合成和代谢。在宿主中，某些BAs激活法尼醇X受体（FXR），导致BA生物合成中的限速酶Cyp7a1的下调。在细菌中，BAs调节胆盐水解酶（BSHs）和bai操纵子基因的表达。因此，我们假设手术改变了水平的BAs可能是负责抑制bai操纵子表达和LCA产生的SI因子。
使用超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS），我们分析了手术后6周假手术和SG小鼠SI内容物中的BAs。一种BA代谢物TDCA的水平在SG SI内容物中显著高于假手术SI内容物，而总BA水平没有变化（图4A）。因此，我们假设TDCA抑制bai操纵子表达和LCA产生。与这一假设一致，TDCA（100 mM）抑制了与CA和CDCA（各100 mM）共同孵育的C. scindens单培养中的LCA产生和baiCD基因表达（图4B-4D和S3A-S3C）。有趣的是，TDCA对DCA产生没有显著影响（图4E和S3D），这表明TDCA特异性地抑制C. scindens的LCA产生，而不是DCA产生。
总的来说，这些结果与我们之前使用SG SI内容物的发现一致，并表明TDCA在体外抑制C. scindens中的LCA产生和baiCD表达。
TDCA是一种结合型次级胆汁酸。在生理环境中，从SI到大肠的TDCA会被肠道细菌的BSHs脱结合成DCA。将C. scindens与DCA（100 mM）共同培养，显著抑制了LCA产生和baiCD基因表达（图4F, 4G, S3E和S3F）。这些数据表明，TDCA和DCA都是LCA产生的抑制剂。LCA和DCA都是由含有bai操纵子的肠道共生菌产生的次级胆汁酸。牛磺胆酸（TLCA），即LCA的牛磺酸结合形式，并未抑制C. scindens中的LCA产生（图4H和S3G），这表明TDCA和DCA特异性地抑制C. scindens中的LCA产生。重要的是，没有任何胆汁酸处理影响C. scindens细菌菌株的生长或活性（图4I和S3H）。最后，我们观察到，在CDCA-d4底物存在的情况下，用100 mM TDCA处理的DIO小鼠的盲肠培养物含有显著较低水平的LCA-d4，并表现出降低的baiCD基因表达，与对照处理的培养物相比（图4J-4L）。这些结果证明，TDCA及其脱结合形式DCA抑制baiCD表达和LCA产生。
图4. TDCA在SG后SI中增加并抑制LCA产生而不影响细菌生长。
(A) 对假手术后或SG后DIO小鼠SI内容物的BA分析显示，SG后TDCA水平显著增加，其他BAs或总BA水平没有变化。LCA低于检测限（假手术n = 15，SG n = 18）。
(B-E) 将C. scindens ATCC与TDCA（100 mM）和CA及CDCA（各100 mM）共同孵育（B），导致LCA产生（C）和baiCD基因表达（D）显著减少，而不改变DCA产生（E）（每组n = 6）。
(F和G) 将C. scindens ATCC与DCA（100 mM）和CDCA（100 mM）共同孵育，导致LCA产生（F）和baiCD基因表达（G）显著减少（每组n = 6）。
(H) 将C. scindens ATCC与100 mM TLCA和CDCA（100 mM）共同孵育不影响LCA产生（每组n = 6）。
(I) TDCA、DCA或TLCA（100 mM）不影响C. scindens ATCC的生长或活性（CFU/mL）（每组n = 6）。
(J-L) TDCA抑制盲肠培养中的LCA产生。在CDCA-d4（100 mM）存在的情况下，将TDCA（100 mM）添加到DIO小鼠的盲肠内容物中进行体外培养（J）。
TDCA显著抑制了LCA的产生（K）和baiCD基因表达（L）（K中每组n = 3，L中每组n = 6）。
我们发现有趣的是，尽管TDCA抑制了LCA的产生，但它并未影响C. scindens单培养或复杂细菌群落中的DCA产生。以前的研究发现，一些bai酶表现出底物特异性。为了确定特定bai操纵子基因的差异性转录调控是否可以解释LCA与DCA产生的差异，我们测试了TDCA和DCA是否影响个别bai操纵子基因的表达。引人注目的是，将C. scindens ATCC与TDCA（100 mM DCA）或DCA（100 mM DCA）共同孵育，导致所有bai基因的表达受到抑制，表明这些化合物全局性地抑制bai操纵子基因的表达（图S3I）。这些结果表明，除了bai操纵子基因表达之外，还有其他调控机制控制LCA和DCA的产生。
TDCA降低LCA水平并改善宿主的代谢表型
为了评估TDCA处理是否降低了体内的LCA水平，DIO小鼠通过每日口服灌胃接受水或10 mg/kg TDCA处理（图5A）。经过4周的治疗，两组之间的体重和器官重量没有观察到差异，这表明TDCA给药没有导致明显的毒性（图S4A和S4B）。通过UPLC-MS BA分析确定，TDCA给药显著降低了结肠中的LCA水平（图5B）。在盲肠、结肠或门静脉中，总BA或其他个别BA的浓度没有显著改变，唯一的例外是结肠中3-oxo-CDCA的水平降低（图S4C–S4E）。最后，与体外观察一致，TDCA处理导致粪便中baiCD基因表达减少（图5C）。这些结果表明，TDCA在体内抑制了细菌LCA的产生。
TDCA处理的小鼠在第2周和第4周的口服葡萄糖耐量测试（OGTT）中显示出增强的葡萄糖清除能力，与接受载体治疗的对照组相比（图5D）。此外，TDCA处理保护了DIO小鼠免受高脂饮食（HFD）诱导的肝脏脂肪变性（图5E–5G）。TDCA还降低了空腹血糖水平，而通过HOMA-IR确定的胰岛素抵抗在TDCA处理和载体处理的动物之间没有差异（图S4F）。这些结果与WAT重量在TDCA处理后保持不变的发现一致（图S4G），因为已经显示胰岛素抵抗与脂肪堆积密切相关。综合这些结果，TDCA抑制了LCA的产生，改善了葡萄糖耐量，并保护了DIO小鼠免受肝脏脂肪变性的影响。
为了调查TDCA处理和载体处理小鼠之间观察到的代谢差异背后的潜在基因调控机制，我们在远端回肠上进行了RNA测序（RNAseq）。我们选择远端回肠是因为这部分胃肠道是营养物质和BA吸收和感知的关键部位。全球转录分析鉴定了42,989个基因，其中25个基因在TDCA处理和载体处理的小鼠之间差异表达（调整后的p < 0.05）。这些基因中的大多数（22个）在TDCA处理的小鼠中减少（表S2）。基因本体（GO）分析显示，在TDCA处理的小鼠中，与对外部刺激的反应、氧化和代谢应激、脂质代谢以及抗菌肽（AMP）产生的途径表达显著减少。相比之下，TDCA处理的动物中与钙离子稳态和血液循环相关的途径显著增加（图5H和5I）。
差异表达基因中最大的一组是与响应氧化应激、代谢应激和毒素相关的基因。保护细胞免受氧化应激损伤的基因表达下调，包括Cbr1和Nqo1，以及响应代谢应激的基因（Hexb和Plbd1）。通过谷胱甘肽结合（Gstm3、Gstm6和Gstp2）或糖醛酸化（Ugt2b35）解毒氧化应激产物的基因表达也减少了。此外，在TDCA处理的动物中，编码参与先天免疫的抗菌肽的基因表达减少，包括血管生成素4（Ang4）、α-防御素（Defa24、Defa26、Defa30和Defa38），以及分泌蛋白Reg3a（Reg3a）。最后，在TDCA处理的小鼠远端回肠中，参与钙介导的信号传导和运输以及肌肉收缩的基因表达（Sgcd、Slc8a1和Trdn）增加（图5I）。这些数据与TDCA处理减少了HFD处理小鼠肠道组织所经历的氧化和代谢应激程度的机制一致。
事实上，TDCA处理后表达减少的几个基因是由核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）调节的，包括Nqo1、Txt、Gstm3、Gstm6、Gstp2和Ugt2b35。这种转录因子在保护细胞免受氧化和亲电性应激以及控制维持氧化还原稳态和解毒有害化合物的多种基因表达中发挥重要作用。对RNA-seq数据的进一步分析揭示了一组Nrf2调节的基因，这些基因的p值（未经调整的p值）小于0.05，但经TDCA处理后负向调节。这些基因包括额外参与氧化应激反应和维持细胞氧化还原状态的基因，包括Sod1、Cat、Txnrd1、Prdx1和G6pdx。在TDCA处理的小鼠中，额外的Nrf2调节基因的表达也下调，这些基因负责谷胱甘肽合成（Gclm和Gclc）、谷胱甘肽转移酶活性（Gstp1）、通过谷胱甘肽减少活性物质（Gpx1）以及糖醛酸化（Ugt2b36和Ugt2b5）（图5I）。Nrf2控制途径中基因的下调进一步支持了TDCA处理减轻了HFD饲养小鼠所经历的氧化和代谢性肠道应激水平的假设。
图5. TDCA降低LCA水平并改善葡萄糖耐量和肝脂肪变性
(A) TDCA剂量实验的示意图。10周龄的DIO小鼠每天通过灌胃给予10 mg/kg TDCA或水，持续4周。
(B和C) TDCA处理的小鼠结肠中的LCA水平（B）和粪便中baiCD表达（C）显著降低。
(D) TDCA处理改善了DIO小鼠的葡萄糖耐量。在第2周和第4周进行OGTT。
(E和F) TDCA处理减少了DIO小鼠的肝脏重量（E）和脂肪变性（F）。
(G) 每组的代表性肝脏图像（2003）。比例尺代表100微米。
(H) 对远端回肠进行的宿主基因表达分析（RNA-seq）显示，TDCA处理的小鼠中氧化应激、代谢应激和毒素应激反应途径的基因表达降低。显示了选定的显著差异调节的基因本体（GO）途径（假发现率[FDR] < 0.05）。
(I) 热图显示了RNA-seq中选定的个别基因的表达。红色的基因由Nrf2调节。每个基因的Log2fold变化、p值和调整后的p值列在表S2中。
胆汁酸是核激素受体和G蛋白偶联受体的配体。TDCA是一种强效的TGR5激动剂和FXR的弱激活剂，而DCA表现出FXR和TGR5激动剂活性。TGR5-GLP-1轴的激活保护了DIO小鼠免受肝脂肪变性和胰岛素抵抗的影响，而肠道FXR及其下游靶标（例如，FGF19/FGF15）在葡萄糖调节中发挥重要作用。在TDCA处理后，通过RNA-seq或qPCR观察远端回肠中Tgr5的表达没有显著差异（图S5A和S5B）。TGR5的激活导致细胞信号传导信使环磷酸腺苷（cAMP）的水平增加。通过RNA-seq观察，编码腺苷酸环化酶亚型（Adcy3、Adcy4、Adcy5、Adcy6、Adcy7和Adcy9）的基因，即负责将ATP转化为cAMP的酶，没有显著差异。TDCA灌胃后GLP-1水平没有显著增加（图S5C）。这些数据表明，TDCA的血糖调节效应不是通过TGR5-GLP-1轴介导的。
根据RNA-seq和qPCR分析，TDCA处理并未改变Fxr的表达。FXR依赖基因Shp和Fgf15的表达在TDCA处理后受到抑制，这表明FXR信号传导有一定程度的抑制，尽管这种差异只在qPCR分析中达到了统计学意义（图S5A和S5B）。用FXR拮抗剂甘氨酸-熊去氧胆酸处理可以减少神经酰胺合成和血清神经酰胺水平，从而增强葡萄糖调节并保护肝脏免受高脂饮食的影响。根据全球转录分析，TDCA处理的小鼠远端回肠中神经酰胺生物合成和分解代谢基因的表达没有显著差异（图S5A）。同样，两组之间的血清神经酰胺水平也没有差异（图S5D）。这些数据表明，神经酰胺信号的改变不太可能是TDCA处理代谢效应的重要贡献因素。
更广泛地说，这些数据表明TDCA处理限制了胃肠道的氧化和免疫应激，而这些变化不太可能由TGR5或FXR信号驱动。
TDCA的代谢益处依赖于微生物群。
由于LCA完全由肠道微生物群产生，我们接下来调查了TDCA的代谢效应是否依赖于微生物群。我们通过在饮用水中添加抗生素混合物，对DIO小鼠的微生物群进行了10天的耗竭。然后，我们通过每日灌胃，用10 mg/kg TDCA或水对小鼠进行了4周的处理。在整个过程中，动物持续接受抗生素处理。据报道，微生物群耗竭的小鼠代谢健康，这可能阻止我们评估抗生素处理的小鼠中TDCA的代谢益处。因此，作为比较，同龄的瘦小鼠也接受了抗生素处理，并接受了水的灌胃（图6A）。经过5周多的治疗，两组DIO小鼠与微生物群耗竭的瘦小鼠相比，表现出更高的葡萄糖与时间曲线下面积（AUCs）（图6B），这表明尽管有所改善，但接受抗生素处理的HFD小鼠仍然表现出异常的葡萄糖耐量。因此，如果在抗生素处理的DIO小鼠中存在，TDCA治疗的葡萄糖处理益处仍然可以观察到。
没有观察到明显的毒性，这从体重和器官重量来看（图S6A和S6B）。正如预期的那样，LCA无法检测到，而结合型宿主产生的胆汁酸牛磺胆酸（TCA）和牛磺熊去氧胆酸（TbMCA）在载体和TDCA处理的DIO小鼠的盲肠和结肠中占主导地位（图S6C和S6D）。牛磺脱氧胆酸（TCDCA）、TUDCA、TCA、TbMCA和α/β-穆里希胆酸（α/βMCA）在两组的门静脉中都检测到低水平，而TDCA只在TDCA处理的DIO小鼠的门静脉中检测到（图S6E）。在微生物群耗竭的小鼠中，TDCA处理的DIO动物在第2周和第4周的OGTT期间的血糖水平与载体处理的小鼠几乎相同。这些数据表明，TDCA处理和载体处理的微生物群耗竭的DIO小鼠仍然不耐葡萄糖。此外，在微生物群耗竭的动物中，TDCA处理不再保护小鼠免受肝脂肪变性的影响（图6C–6E）。这些结果表明，微生物群对于TDCA在宿主代谢中的血糖调节和抗脂肪变性效应是必需的。
接下来，我们研究了LCA喂养是否会逆转TDCA给药的有益效应。DIO小鼠每天通过灌胃给予水或10 mg/kg TDCA，持续4周。另外一组接受TDCA灌胃的小鼠在食物中添加了0.03% LCA（重量/重量）（图6F）。在第2周和第4周的OGTT期间，接受TDCA处理的小鼠显示出了先前观察到的葡萄糖清除改善。值得注意的是，TDCA+LCA组与仅接受TDCA组相比显示出葡萄糖清除受损。特别是，TDCA+LCA组在第2周和第4周与接受TDCA处理的组相比，显示出更高的血糖AUC（图6G）。这些数据表明，当LCA重新引入肠道时，TDCA对宿主的血糖调节益处显著减少。通过食物喂养LCA也减少了TDCA对肝脏脂肪变性的保护作用（图6H和6I）。总的来说，这些结果表明TDCA的代谢益处在很大程度上是通过抑制LCA产生来介导的。
图6. TDCA的代谢益处需要肠道微生物群，并且通过LCA喂养被减弱
(A) TDCA抗生素实验的示意图。DIO小鼠接受抗生素治疗10天，然后每天通过灌胃给予10 mg/kg TDCA或水，并继续接受抗生素治疗。作为对照，接受抗生素治疗的瘦小鼠通过灌胃给予水。NC，正常饲料。
(B-E) 微生物群对TDCA的血糖调节效应是必需的。在第2周和第4周进行OGTT（B）。在载体和TDCA处理的DIO小鼠之间，葡萄糖耐量（B）、肝脏重量（C）或脂肪变性（D和E）没有观察到差异。
(F) TDCA+LCA实验的示意图。DIO小鼠每天通过灌胃给予水或10 mg/kg TDCA，持续4周。一组接受TDCA处理的小鼠在食物中添加了0.03% LCA（重量/重量）。
(G-I) LCA喂养显著抵消了TDCA处理的有益效应。
在2型糖尿病（T2D）患者中，小肠（SI）中TDCA的丰度降低
接下来，我们想要确定患者小肠（SI）中TDCA水平是否与血糖控制有关。在减肥手术期间，从被分类为非糖尿病、糖尿病前期和2型糖尿病（T2D）的肥胖患者中收集了近端空肠，并通过对UPLC-MS进行BA分析。与T2D患者相比，非糖尿病个体SI组织中TDCA的丰度显著更高（图7）。糖尿病前期个体SI组织中TDCA的平均丰度介于非糖尿病和T2D水平之间。总的来说，这些数据显示TDCA的相对丰度与人类更健康的血糖调节状态正相关。重要的是，TDCA是与非糖尿病患者相比，在T2D中表现出显著降低的唯一BA。与TDCA相反，非糖尿病人类SI组织中TCA的丰度比T2D组显著降低（图7）。这些数据显示，与我们的体内小鼠数据一致，患者SI中TDCA的丰度随着糖尿病状态的恶化而降低，并表明TDCA可能在人类中发挥血糖调节效应。
图7. 糖尿病患者近端空肠中TDCA的丰度降低
在接受减肥手术的肥胖患者中，对近端空肠中的胆汁酸进行了定量分析。患者被分为非糖尿病组（女性n = 30，男性n = 10）、糖尿病前期组（女性n = 17，男性n = 6）或2型糖尿病组（女性n = 21，男性n = 5，女性用黑色表示，男性用红色表示）。
讨 论
在这项研究中，我们发现减肥手术后小肠（SI）中TDCA水平的增加抑制了大肠中肠道细菌产生LCA，从而改善了宿主的血糖调节。健康人体内内源性LCA的水平被认为无毒；然而，LCA的较高浓度可能导致疾病，包括肝脏和结肠癌。饮食补充1% LCA 48小时就足以在小鼠中诱导肝细胞坏死。LCA的高毒性可能阻碍了对其对宿主其他表型影响的研究，包括代谢。MASLD中血清和粪便LCA水平的升高，以及DIO小鼠和减肥手术后肥胖患者盲肠LCA水平的降低暗示LCA与不利的代谢变化有关。在这里，我们建立了一个LCA喂养模型，该模型能够在不引起肝毒性的情况下研究这种化合物的代谢影响。利用这个模型，我们确定LCA是一种代谢毒素。具体来说，我们展示了LCA扰乱了葡萄糖代谢并增加了脂肪组织，而没有改变体重。
以前的研究发现一些胆汁酸（BAs）可以诱导bai操纵子，而DCA抑制bai操纵子的表达。这里，我们观察到DCA对bai操纵子表达有类似的抑制效应，并鉴定了另一个内源性bai操纵子抑制剂TDCA。尽管这两种化合物都抑制了LCA的产生，但它们都没有显著降低C. scindens单培养、复杂盲肠培养或小鼠中DCA的水平。TDCA和DCA对LCA和DCA产生差异性抑制作用的机制尚不清楚。已经观察到未结合和结合型内源性BA代谢产物在诱导bai操纵子方面的显著差异。有可能在不同条件下或在添加抑制剂后的不同时间点，TDCA和DCA可能不同地改变某些bai基因的表达，导致LCA与DCA产生的不同。也有可能抑制机制在蛋白质水平上起作用，而不是在转录水平上。例如，BaiF，辅酶A（CoA）转移酶，据报道当DCA-CoA是CoA供体时，对CA的底物特异性高于CDCA。BA转运蛋白BaiG诱导CDCA进入细胞的量比CA多。这种蛋白质水平的差异可能导致LCA与DCA的不同产生。最后，含有bai操纵子的共生菌株表现出不同的7α-脱羟基活性。在这项研究中，我们观察到与C. scindens ATCC相比，C. scindens VPI菌株整体次级BA产生水平较低。最近的一项研究发现，与DCA相比，人类C. scindens分离物产生的LCA量微不足道。有可能C. scindens菌株中LCA与DCA产生的相对速率可能因TDCA或DCA的存在而改变，导致这些代谢产物的不同产生。我们的研究表明，对次级BA生物合成的控制比之前认为的更为微妙，并激发了进一步研究DCA和LCA产生背后机制的研究。未来的工作调查与bai操纵子相关的小分子、基因和蛋白质网络，可能会揭示TDCA和DCA抑制特异性的起源。
我们的全球转录数据表明，TDCA处理降低了高脂饮食（HFD）喂养小鼠肠道的细胞应激。HFD提高了氧化应激的水平。此外，氧化应激及其相关的炎症可能导致代谢功能障碍，包括葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。然而，目前尚不清楚TDCA处理后氧化应激反应的减少是否有助于观察到的改善代谢表型，或者TDCA是否通过一个尚未确定的机制改善了葡萄糖不耐受，从而减少了胃肠道的压力。
我们的数据不支持TDCA有益的代谢效应主要是由于调节FXR或TGR5信号传导的结论。引人注目的是，口服TDCA对葡萄糖代谢的影响完全依赖于微生物群的存在。然而，LCA重新喂养只导致了TDCA的部分但不完全的挽救，这表明TDCA可能通过依赖LCA和不依赖LCA的途径发挥有益的代谢效应。已经显示，包括LCA在内的疏水性BAs能够诱导氧化应激。因此，TDCA减少LCA产生可能有助于减少肠道的氧化应激。然而，这种压力的减少是否有助于改善TDCA处理小鼠的代谢参数仍然不清楚。
在TDCA处理的小鼠中，编码抗菌肽（AMPs）的基因表达减少，包括α-防御素、Ang4和Reg3a。DCA已被证明可以通过FXR独立机制下调Paneth细胞AMPs， 这提出了TDCA处理可能直接影响宿主AMP产生的假设。AMPs在先天免疫中扮演重要角色，保护机体免受病原体感染。此外，这些AMPs塑造了SI微生物群的组成。鉴于微生物群对宿主能量平衡和葡萄糖代谢的影响，TDCA对某些AMPs表达的抑制作用可能会以有利于宿主代谢的方式改变微生物群落的组成。TDCA对葡萄糖耐量的影响依赖于微生物群，这与假设一致。此外，最近研究发现SG影响了AMP Reg3g的水平（尽管在TDCA处理后增加但未显著），并且这种AMP调节SI微生物群的组成，并在SG后改善了葡萄糖稳态，进一步表明AMPs可能发挥代谢效应。未来的工作需要阐明TDCA、AMPs、SI微生物群组成和宿主代谢表型之间的关系。尽管如此，通过研究减肥手术，我们已经发现了一条途径，将SI BA（TDCA）和结肠微生物代谢物（LCA）与宿主葡萄糖代谢的调节因果联系起来。此外，我们已经证明在体内抑制bai操纵子和LCA产生是可行的，为针对这一途径治疗以LCA水平升高为特征的疾病（如T2D和结肠及肝癌）开辟了可能性。
研究局限性
我们专注于将手术后小型和大型肠中BA水平的变化与细菌BA代谢和宿主代谢反应的变化联系起来。然而，仍有许多未解之谜。目前尚不清楚SG如何导致SI中TDCA水平增加。SG显著改变了SI中营养物质的通量和可用性。鉴于BAs在营养物质感应、脂肪和维生素吸收以及肠肝系统中的代谢稳态中的重要作用，改变的SI BA水平可能是宿主对手术后改变的营养状况的反应。在SG后立即对手术部位胃和宿主BA合成部位肝脏进行转录和蛋白质水平变化的调查，可能会揭示BA相关途径的变化，这些变化是肠道TDCA水平变化的基础。
这些研究局限性表明，尽管我们已经取得了一些进展，但减肥手术如何影响肠道微生物群和宿主代谢的具体机制仍需要进一步的研究。未来的研究可能会探索手术对胃肠道其他部位的影响，以及这些变化如何与肠道BA水平和微生物群组成的变化相互作用。此外，还需要更多的研究来确定TDCA和其他BA在调节宿主代谢中的作用，以及这些发现是否可以转化为治疗2型糖尿病和其他代谢性疾病的新策略。
此外，bai操纵子减少LCA产生在SG有益效应中的作用尚不清楚。目前还无法从常规定植的小鼠中选择性地去除含有bai操纵子的细菌，而且需要对手术方法进行大量修改和优化，才能在无菌（GF）或单定植小鼠上进行SG。此外，与假手术动物相比，SG动物在安乐死时体重较轻，这与手术已知的减重表型相符。未来的研究使用配对喂养、体重匹配的SG和假手术动物，将揭示SG后SI内容物抑制LCA的效果是否依赖于体重。
这些考虑强调了在将这些发现转化为临床应用之前，需要对SG如何影响肠道微生物群和宿主代谢的复杂相互作用进行更深入的理解。此外，还需要考虑手术对不同个体的潜在影响，以及如何通过调节肠道微生物群和代谢物水平来优化治疗效果。未来的研究可能会探索新的策略，如粪便微生物群移植（FMT）或特定细菌定植，以模拟SG的代谢益处，同时避免手术的风险和并发症。
BA定量分析仅在安乐死后的一个时间点进行，这阻止了我们研究TDCA和LCA在不同组织中的分布的药代动力学，以及这些化合物在肝脏中转化为宿主来源的BAs的潜在过程。此外，体外BA处理仅在一个浓度（100 mM）下进行。有可能TDCA和DCA在不同条件下对bai操纵子有不同的影响，这些条件我们在这里尚未探索。
最后，由于人类研究的伦理和安全限制，目前在大多数患者中在SG后收集肠道组织尚不可能。我们从接受胃旁路手术的患者那里获得了空肠活检，这些患者在形成空肠-空肠吻合术时有空肠组织可用。这些样本的数据代表了上SI中旁路前的BA水平。粪便样本更容易从术前和术后的患者那里获得，尽管粪便和结肠中的BA浓度不同，但可以比较相对的粪便BA水平。未来对非糖尿病、糖尿病前期和T2D患者的粪便进行分析，以及对术前和术后减肥手术患者的扩展、纵向研究，将揭示BA水平与患者表型之间的相关性，这些相关性可以在因果体外和体内研究中进一步探索。
往期推荐
