【科研】肠道菌群降解睾酮与男性抑郁症有关

睾酮缺乏可能导致人类出现抑郁症状，但是这种缺乏的原因尚不完全清楚。在这里，我们从睾酮缺乏的抑郁症患者的粪便样本中分离出了新金色分枝杆菌（Mycobacterium neoaurum），并证明了这种菌株能够在体外降解睾酮。此外，用新金色分枝杆菌灌胃大鼠，降低了它们的血清和脑睾酮水平，并诱导了抑郁样行为。我们鉴定了编码3β-羟类固醇脱氢酶（3β-HSD）的基因，作为导致睾酮降解的酶。将3β-HSD导入大肠杆菌（Escherichia coli）中，增强了它降解睾酮的能力。用产生3β-HSD的大肠杆菌灌胃大鼠，降低了它们的血清和脑睾酮水平，并引起了抑郁样行为。最后，与没有抑郁症的参与者的16.67%相比，抑郁症患者的粪便样本中有42.99%（46/107）携带了3β-HSD，其中60.87%（28/46）的粪便样本表达了3β-HSD。这些结果表明，肠道菌群表达的3β-HSD可能与由于睾酮降解引起的抑郁症状有关。

抑郁障碍是一个重大的公共卫生问题。2017年，世界卫生组织（WHO）宣布抑郁障碍成为全球致残的主要原因。男性抑郁的发生率随着年龄相关的睾酮水平下降而增加。然而，睾酮缺乏也发生在年轻男性身上，并与抑郁症状有关。在美国，大约6%的一般男性人口（年龄在30到79岁之间）存在睾酮缺乏。有时，睾酮缺乏可能是一个原发性表现（例如，腮腺炎睾丸炎和克氏综合征），而在其他情况下，它可能是一个继发性表现（例如，垂体损伤和过度饥饿）。然而，抑郁症患者睾酮缺乏的原因尚未得到阐明。

睾酮是一种由睾丸、肾上腺和脂肪组织产生的神经活性类固醇激素。经过肝脏的代谢后，睾酮通过胆汁排出到肠道，然后有83%的睾酮被重新吸收到血液中。最近，有报道称肠道菌群通过改变类固醇激素的活性和非活性形式的比例，影响了一些类固醇激素的水平。因此，肠道菌群对类固醇激素的代谢可能影响某些疾病的发生或治疗。例如，肠道菌群通过提供另一种雄激素的来源，促进了去势抵抗性前列腺癌的内分泌耐药性。抑郁障碍患者的肠道菌群与健康对照组有显著差异，其特征是变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌属（Bacteroides）的丰度增加。在多样的自然环境中，变形菌门和放线菌门被鉴定为类固醇降解者。因此，抑郁症患者的肠道菌群可能比正常人群具有更强的降解类固醇的能力。

鉴于睾酮是一种类固醇激素，我们假设抑郁症患者的肠道中可能存在一些能够降解睾酮的微生物，导致血清睾酮水平下降和随后的抑郁。因此，在本研究中，我们评估了睾酮缺乏、抑郁和肠道菌群之间的关系。

为了探究抑郁症患者的肠道菌群是否能够降解睾酮，我们用睾酮（2 g/L）培养了肠道菌群。薄层色谱（TLC）分析显示，在抑郁症患者中，有83%（5/6）的粪便可以将睾酮降解为雄烯二酮（AD），有67%（4/6）的粪便可以进一步降解AD。而在非抑郁组中，所有（6/6）的粪便样本都没有明显的睾酮降解。

此外，为了确定抑郁症患者的肠道菌群是否能够降低睾酮水平并引起类似抑郁的行为，我们通过灌胃进行了粪便移植。大鼠被分为以下3组：（1）对照组，每天灌胃1毫升生理盐水，连续3天；（2）非抑郁菌群组，每天移植1毫升来自非抑郁参与者的肠道菌群，连续3天；（3）抑郁菌群组，每天移植1毫升来自抑郁症患者的肠道菌群，连续3天（图1A）。

由于所有的大鼠在灌胃前一周内都用含有抗生素混合物（ABX）的饮用水来消耗肠道菌群，这可能会影响血清睾酮水平，所以我们检测了未经处理的大鼠和ABX处理的大鼠之间的血清睾酮水平。治疗后四周，两组之间没有明显差异（图S1B），这进一步表明ABX处理在这种条件下对血清睾酮水平没有影响。然后，我们用参与者的肠道菌群灌胃给ABX处理的大鼠；使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量血清睾酮，结果显示抑郁菌群组的血清睾酮水平显著低于对照组（118 ± 31 ng/dL 对 232 ± 90 ng/dL; p = 0.018；图1B）和非抑郁菌群组（118 ± 31 ng/dL 对 225 ± 75 ng/dL；p = 0.033$；图1B）。接下来，我们使用LC-MS/MS定量大脑睾酮水平，结果显示抑郁菌群组的大脑睾酮水平显著低于对照组（5.04 ± 2.37 ng/g 对12.61 ± 3.78 ng/g;，p = 0.042；图1C）和非抑郁菌群组（5.04 ± 2.37 ng/g 对 14.39 ± 7.16 ng/g; p = 0.012；图1C）。

行为实验表明，在尾悬实验（TST）和强迫游泳实验（FST）中，抑郁菌群组的大鼠的不动时间长于对照组和非抑郁菌群组的大鼠，而在新颖抑制进食（NSF）和喷溅实验中，抑郁菌群组的大鼠的潜伏时间长于对照组和非抑郁菌群组的大鼠（图1D和S3A–S3C）。

这些结果表明，来自抑郁症患者的肠道菌群可以降低血清和大脑中的睾酮水平，并在大鼠中诱发类似抑郁的行为。

图1. 接受抑郁症患者粪便移植的大鼠表现出类似抑郁的行为

(A)    对照组大鼠、非抑郁菌群受体大鼠和抑郁菌群受体大鼠的实验时间线。所有大鼠（7周龄）在灌胃前用含有抗生素的饮用水处理7天，然后用高压灭菌水处理1天。对照组大鼠每天灌胃1毫升生理盐水，连续3天。非抑郁菌群组大鼠每天灌胃1毫升来自非抑郁参与者的肠道菌群，连续3天。抑郁菌群组大鼠每天灌胃1毫升来自抑郁症患者的肠道菌群，连续3天。灌胃第一天后的四周内，对大鼠进行了为期一周的行为观察，然后测量睾酮水平和行为分析。

(B)    使用目标液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定对照组大鼠（n = 6）、非抑郁菌群受体大鼠（n = 6）和抑郁菌群受体大鼠（n = 6）血清中的睾酮浓度。

(C)    使用目标液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定对照组大鼠（n = 6）、非抑郁菌群受体大鼠（n = 6）和抑郁菌群受体大鼠（n = 6）大脑中的睾酮浓度。

(D)   对照组大鼠（n = 6）、非抑郁菌群受体大鼠（n = 6）和抑郁菌群受体大鼠（n = 6）在强迫游泳实验（FST）中的不动时间，在尾悬实验（TST）中的不动时间，在喷溅实验中的梳理潜伏时间，在新颖抑制进食（NSF）中的进食潜伏时间。数据以均值±标准误差（± SEM）表示，使用单因素方差分析和Tukey多重比较检验计算统计显著性（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。

由于肠道菌群对睾酮的降解可以降低血清睾酮水平，我们用睾酮作为唯一的碳源来培养一位未经治疗的抑郁症患者的粪便；我们分离出了几种细菌，但只有一种能够降解睾酮（图2A）。然后，我们进行了测序分析来鉴定这种细菌。在系统发育树中，这种菌株的16S rRNA序列与新金黄色分枝杆菌（Mycobacterium neoaurum）的相似度为99.0%–99.8%，与其他分枝杆菌属（Mycobacterium）的相似度为98.6%–99.7%。我们将这种菌株命名为M. neoaurum MN2019。虽然M. neoaurum是用睾酮作为唯一的碳源分离出来的，但这种菌株也可以在含有一般碳源的培养基中生长，比如在LB培养基或血琼脂平板上。药敏试验显示，M. neoaurum MN2019对红霉素和阿米卡星敏感；M. neoaurum中红霉素的最低抑菌浓度（MIC）为0.25 mg/L，阿米卡星的MIC为0.75 mg/L（图S4A）。M. neoaurum最初是在1972年从土壤中分离出来的（Tsukamura，1972），也被发现在临床感染中，如血流感染，人工瓣膜心内膜炎，血管导管感染和肺部感染。虽然M. neoaurum可以转化几种固醇，但其降解睾酮的能力尚未被报道。

我们使用了一种固醇降解的发酵培养基，并添加了睾酮（2 g/L）作为辅助生长的碳源，以验证新金黄色分枝杆菌（M. neoaurum）的降解能力，这与前一项研究一致。薄层色谱（TLC）结果显示，与标准品相比，睾酮水平逐渐降低，而主要产物雄烯二酮（AD）的水平逐渐增加（图S4B）。高效液相色谱（HPLC）定量分析显示，睾酮水平降低。培养96小时后，睾酮水平降低了91.78%。代谢产物包括AD、雄烯二烯-3,17-二酮（ADD）和9α-羟基雄烯二烯-3,17-二酮（图2B和2C）。主要代谢产物是AD，占所有代谢产物的91.85%（图2C）。这些结果表明，睾酮可以被新金黄色分枝杆菌降解。

图2. 能够降解睾酮的细菌的分离和验证

(A) 新金黄色分枝杆菌（M. neoaurum）的典型菌落的图像。

(B) 新金黄色分枝杆菌对睾酮的降解过程。数据点表示睾酮水平的均值±标准差（3个生物重复）。

(C) 组合提取离子色谱图（EICs）显示新金黄色分枝杆菌对睾酮的时间依赖性降解。该菌株在含有2 g/L睾酮的培养基中生长，从指定的时间点取样并用高效液相色谱（HPLC）进行分析。

(D) 睾酮的降解途径。

为了探究肠道中的新金黄色分枝杆菌（M. neoaurum）是否能够引起类似抑郁的行为，我们通过灌胃给大鼠施用了M. neoaurum。大鼠被分为以下3组：（1）对照组，每天灌胃1毫升生理盐水，连续3天；（2）M. neoaurum受体组，每天灌胃M. neoaurum（约$1 \times 10^8$个形成菌落单位[cfu]），连续3天；（3）红霉素治疗组，在口服M. neoaurum后，用红霉素（每天10 mg/kg）治疗，连续7天（图3A）。

使用LCMS/MS测定血清睾酮水平，结果显示接受M. neoaurum的大鼠的血清睾酮水平显著低于对照组（93 ± 75 ng/dL对243 ± 104 ng/dL；p = 0.002；图3B）。接下来，我们使用LC-MS/MS测定了大脑睾酮水平，结果显示接受M. neoaurum的大鼠的大脑睾酮水平也显著低于对照组（4.56 ± 3.07 ng/g对12.41 ± 4.67 ng/g；p < 0.001；图3C）。

行为实验显示，在TST和FST中，接受M. neoaurum的大鼠的不动时间比对照大鼠长，在NSF和splash测试中，接受M. neoaurum的大鼠的潜伏时间也比对照大鼠长（图3D和S3D-S3F）。为了评估M. neoaurum经口灌注后的存活情况，我们在行为测试后培养了接受M. neoaurum的大鼠的粪便，并分离出类似M. neoaurum的菌落，进一步使用16S rRNA测序进行确认。然而，从对照大鼠的粪便中没有分离出M. neoaurum。接下来，我们还对从接受M. neoaurum的大鼠的粪便中提取的总RNA进行了实时逆转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）。我们选择了M. neoaurum的特异性标记基因（数据S1），设计了M. neoaurum的特异性引物，并显示了基因转录在接受M. neoaurum的大鼠的肠道中（n = 12），而不在对照大鼠的肠道中（n = 12）（图S5A和S5B）。这些结果表明，M. neoaurum从灌注到行为测试期间在接受M. neoaurum的大鼠的肠道中存活。

为了确定抗生素治疗是否能够缓解接受M. neoaurum的大鼠的血清睾酮缺乏和抑郁样行为，我们通过灌注给予红霉素1周（每天10 mg/kg）（图3A）。红霉素灌注后2周，LC-MS/MS分析显示，接受红霉素治疗的M. neoaurum大鼠的血清睾酮水平（238 ± 115 ng/dL）恢复到对照组的水平（243 ± 104 ng/dL；p = 0.994；图3B）。我们还使用LC-MS/MS测定了大脑睾酮水平，并显示接受红霉素治疗的M. neoaurum大鼠的大脑睾酮水平（11.45 ± 4.78 ng/g）也恢复到对照组的水平（12.41 ± 4.67 ng/g；p = 0.844；图3C）。

在行为实验中，接受红霉素治疗的M. neoaurum大鼠和对照大鼠在FST和TST中的不动时间以及在NSF和splash测试中的潜伏时间相似。这些结果表明，接受M. neoaurum的大鼠的抑郁样行为在红霉素治疗后得到缓解（图3D和S3D-S3F）。为了确定红霉素治疗是否影响M. neoaurum的存活，我们在行为测试后培养了接受红霉素治疗的M. neoaurum大鼠的粪便，没有分离出M. neoaurum。接下来，我们对从接受红霉素治疗的M. neoaurum大鼠的粪便中提取的总RNA进行了qRT-PCR，并显示了基因在接受红霉素治疗的M. neoaurum大鼠的肠道中没有转录（n = 12）（图S5C）。这些结果表明，M. neoaurum被红霉素杀死。

这些数据显示，用M. neoaurum灌注降低了血清和大脑的睾酮水平，并诱导了大鼠的抑郁样行为。此外，用红霉素补充恢复了睾酮水平和行为。

图3. 接受M. neoaurum的大鼠表现出抑郁样行为

我们推断M. neoaurum灌胃对抑郁样行为的影响可能归因于它降解睾酮的能力；因此，我们假设通过引入一种睾酮降解酶基因来构建一种睾酮降解菌株，能够在大鼠灌胃后诱导抑郁样行为。为了构建重组大肠杆菌，我们试图找到M. neoaurum中一种睾酮降解酶的基因序列。

关于类固醇降解的信息是使用BLAST从京都基因与基因组百科数据库处理的。不幸的是，在M. neoaurum VKM Ac-1815D中没有鉴定出睾酮降解酶3β/17β-羟基类固醇脱氢酶(EC 1.1.1.51)。因此，我们接下来测序了M. neoaurum MN2019的基因组。在M. neoaurum MN2019染色体中(核苷酸的GC含量为66.26%，登录号：CP074376)，通过注释鉴定出编码3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)的基因MN2019_09885(图4A；数据S2)。为了构建一种睾酮降解菌株，含有MN2019_09885基因的pET28a转化到E. coli BL21 (DE3)细胞中，得到E. coli BL21 (DE3)/pDL01(图S6A)。载体pET28a被引入到E. coli BL21 (DE3)中，构建E. coli BL21 (DE3)/pET28a作为对照(图S6B)。使用PCR，我们验证了MN2019_09885基因存在于E. coli BL21 (DE3)/pDL01中，但不存在于E. coli BL21 (DE3)/pET28a中(图S6C)。

随后，我们将E. coli BL21 (DE3)/pDL01或E. coli BL21 (DE3)/pET28a与LB培养基中的睾酮(2 g/L)共同培养。TLC分析显示，与标准品相比，E. coli BL21 (DE3)/pDL01以时间依赖的方式将睾酮转化为AD(图S6D)。相反，E. coli BL21 (DE3)/pET28a没有转化睾酮(图S6E)。代谢产物使用LC-MS/MS鉴定，证实了E. coli BL21 (DE3)/pDL01降解睾酮的产物是AD(图4B)。睾酮和AD的水平使用HPLC定量，E. coli BL21 (DE3)/pDL01能够在24小时内将71.20%的睾酮转化为AD，在48小时内将89.41%的睾酮转化为AD(图4C)。

图4. 体外评估3β-脱氢途径

5、M. neoaurum和3β-HSD在抑郁症患者中普遍存在

为了评估M. neoaurum和3β-HSD在人类肠道中的流行情况，我们使用实时聚合酶链反应(qPCR)检测了没有抑郁症(n = 102)和有抑郁症(n = 107)的参与者的粪便DNA中M. neoaurum和3β-HSD的宏基因组流行情况。M. neoaurum和3β-HSD的基因分别使用特异性和简并性引物扩增。对于酶的简并性引物，使用BLAST比较了MN2019_09885序列，并选择了所有同源基因来设计保守区域的引物。

结果显示，M. neoaurum在抑郁症组的患者中存在率为4.67%(5/107)，而在非抑郁症组的患者中没有检测到。此外，3β-HSD在抑郁症组的患者中存在率为42.99% (46/107)，而在非抑郁症组的患者中存在率为16.67% (17/102) (图5A)。这些数据表明，M. neoaurum主要存在于抑郁症患者中，而3β-HSD在抑郁症患者中的分布比在健康人群中更广泛。此外，3β-HSD的分布比M. neoaurum的分布更广泛，表明M. neoaurum可能不是肠道中唯一表达3β-HSD的细菌。

接下来，为了研究没有抑郁症(n = 102)和有抑郁症(n = 107)的参与者中3β-HSD的表达水平，我们使用qRT-PCR检测了粪便RNA。结果显示，3β-HSD在抑郁症组的患者中转录率为26.17% (28/107)，而在非抑郁症组的参与者中转录率为4.90% (5/102) (图5A)。将这些结果与qPCR数据进行比较，我们观察到，抑郁症组的患者中有60.87% (28/46)在肠道中显示出3β-HSD的转录，而非抑郁症组的这一比例为29.41% (5/17)，这表明抑郁症患者中的睾酮降解细菌在表达3β-HSD方面更活跃。

为了探索3β-HSD和血清睾酮之间的关系，进行了相关性分析。结果显示，3β-HSD DNA的Ct值(r = 0.257; p =0.001; 图5B)和3β-HSD RNA的Ct值(r = 0.266; p < 0.001; 图5C)都与血清睾酮呈正相关，这表明血清睾酮可能受到肠道3β-HSD的影响。

睾酮缺乏会导致抑郁障碍的观点在50多年前就被提出了；然而，相对较少的研究探讨了睾酮缺乏的原因。Diczfalusy等人(1962)首次发现类固醇激素可以在肠道中转化为其他物质，导致类固醇激素被重新吸收到血液中的量减少。此外，最近的研究表明，肠道菌群可以通过降解途径改变类固醇激素的活性和非活性形式的比例，从而影响一些类固醇激素的水平。然而，肠道菌群在睾酮代谢中对抑郁症发病机制的作用尚未被研究。在本研究中，我们发现肠道菌群可以通过降解睾酮降低血清和脑部的睾酮水平，并导致抑郁症状。

我们的结果为一种以前未知的机制提供了证据，即肠道菌群与血清和脑部睾酮水平之间的关系。有报道显示，通过灌胃给予成年雄性盲肠内容物的雌性小鼠的血清睾酮水平显著升高，这表明肠道菌群可以改变睾酮水平。在本研究中，M. neoaurum，一种能够降解睾酮的细菌，降低了血清和脑部的睾酮水平，可能是因为睾酮在被重新吸收到血液循环之前就被M. neoaurum产生的3β-HSD降解了。M. neoaurum MN2019的存在并不令人惊讶，因为已有报道显示分枝杆菌可以利用天然固醇或其他一些类固醇化合物作为唯一的能量和碳源。M. neoaurum是一种快速生长的分枝杆菌，能够降解天然固醇。此外，M. neoaurum NwIB-01是从使用固醇作为唯一碳源的土壤中分离出来的，并发现它能够将植物固醇转化为AD、ADD和9α-羟基-4-雄烯-3,17-二酮。值得注意的是，M. neoaurum目前被用于制药工业，通过植物固醇降解来生产AD或ADD。由于在肠道中表达3β-HSD的工程化E. coli导致大鼠出现抑郁样行为，我们推测在肠道中表达3β-HSD的细菌可能具有降低血清睾酮并导致宿主抑郁的共同特征。这些数据证明了肠道菌群降解睾酮在抑郁样行为中的作用，并为理解睾酮缺乏相关的抑郁障碍提供了遗传基础。AD是睾酮的一种弱活性形式，对雄激素受体的亲和力较低。因此，当睾酮被肠道中的3β-HSD转化为一种弱活性形式时，血清和脑部的睾酮水平就会降低。这些结果与之前的结果一致，表明肠道菌群可以通过降解途径改变活性和非活性类固醇水平的比例，从而影响一些类固醇激素的水平。

我们的研究发现了一种由肠道中降解睾酮的细菌引起的抑郁症类型，导致睾酮水平下降和临床性低促性腺激素症继发的抑郁症状。值得注意的是，我们的研究结果只显示了与低睾酮水平有关的特定的抑郁症，而不是所有符合性腺功能减退临床标准的抑郁症。以前的一篇综述指出，对于临床性低促性腺激素症继发的抑郁症状，有强有力的证据支持睾酮替代治疗的有效性；对于没有临床性低促性腺激素症的男性的亚临界抑郁症状，有初步的证据支持睾酮增强的有效性；对于没有临床性低促性腺激素症的男性的难治性MDD，有强有力的证据表明睾酮增强没有益处。我们的结果证明了睾酮补充能够有效地缓解大鼠的抑郁样行为，从而强化了之前的结论。未来的研究可以比较睾酮补充在有睾酮降解细菌感染的患者和其他有临床性低促性腺激素症继发的抑郁症状的患者之间的效果。确定使用抗生素清除这类患者中的细菌的效果将提供进一步的见解。

许多研究表明，放线菌在抑郁症患者的肠道中比在对照组的肠道中更丰富。然而，放线菌与抑郁症之间的关系尚不清楚。事实上，放线菌可以代谢类固醇。因此，放线菌科中的许多细菌可能会降解睾酮。我们推测，放线菌可能通过降解睾酮，降低血清和脑部的睾酮水平，导致抑郁症。

然而，仍有一些未解决的问题。首先，我们的结果显示，3β-HSD在抑郁症组中的分布比M. neoaurum更普遍，表明M. neoaurum不是肠道中唯一携带3β-HSD的细菌。其他能够降解睾酮的细菌在本研究中没有被评估。其次，3β-HSD也在非抑郁症组的肠道中被检测到，表明在研究肠道中的3β-HSD是否导致抑郁症时，应该考虑其他因素，如酶活性、酶表达、肠道环境中的酶抑制剂，以及宿主的血清睾酮的产生和调节。酶活性与血清和脑部睾酮水平之间的关系应该在进一步的研究中进行探索。

睾酮缺乏、肠道菌群代谢和抑郁症发病机制之间的关系的发现，具有广泛的健康相关意义。我们的研究揭示了一种可能的机制，即肠道中携带3β-HSD的微生物降解睾酮与抑郁风险升高相关。肠道菌群在这一机制中的作用提示了可以改变的预防睾酮缺乏和/或抑郁障碍的风险因素。进一步的研究应该关注随机、双盲、对照的临床试验，探索有效的干预措施，如抗生素治疗、睾酮补充或3β-HSD抑制剂，以预防睾酮缺乏或抑郁障碍。

本文译自：

Li D, Liu R, Wang M et al. 3β-Hydroxysteroid dehydrogenase expressed by gut microbes degrades testosterone and is linked to depression in males. Cell Host Microbe. 2022 Mar 9; 30(3):329-339.