【科研】中性粒细胞：从炎症性肠病到肠道菌群

本文译自：Danne C, Skerniskyte J, Marteyn B, Sokol H. Neutrophils: from IBD to the gut microbiota. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2024 Mar;21(3):184-197.

发表杂志：Nat Rev Gastroenterol Hepatol

影响因子：67

通讯作者：Camille Danne

作者单位：Paris Center For Microbiome Medicine, Paris, France

炎症性肠病（IBD）是一种慢性炎症性胃肠道疾病，由先天和/或适应性免疫反应的功能障碍引起。受损的先天免疫导致对肠道菌群变化的控制不足，激活了适应性免疫系统，促进了次级炎症反应，这种反应是组织损伤的原因。在IBD中，中性粒细胞是先天免疫的关键参与者，但与其他免疫细胞相比，它们的作用被忽视了。关于IBD中性粒细胞的最新研究揭示了意外的复杂性，存在异质性群体和双重功能，对宿主既有害处也有保护作用。与此同时，疾病发生、肠道微生物群和中性粒细胞之间的相互关系也得到了强调。许多IBD易感基因（如NOD2、NCF4、LRRK2、CARD9）涉及与防御微生物有关的中性粒细胞功能。此外，涉及中性粒细胞功能障碍的严重单基因疾病，包括慢性肉芽肿病，其特点是肠道炎症模仿IBD和肠道菌群的变化。这一观察结果证明了中性粒细胞、肠道炎症和微生物群之间的对话。中性粒细胞以多种方式影响微生物群的组成和功能。反过来，微生物因素，包括代谢产物，直接和间接调节中性粒细胞的产生和功能。进一步研究中性粒细胞在宿主-微生物群相互作用中的多样化角色至关重要，无论是在稳态还是在炎症条件下，以开发新的IBD治疗方法。在这篇综述中，我们讨论了中性粒细胞在IBD中的作用，鉴于证明中性粒细胞和肠道微生物群之间存在强有力相互联系的新证据，特别是在炎症背景下。

炎症性肠病（IBD），包括克罗恩病和溃疡性结肠炎的病因仍然神秘。它是由遗传倾向、肠道微生物群的改变和环境因素的组合造成的。本质上，IBD是一种炎症状况。然而，它并不是自发性过度激活炎症途径的后果，正如在自身炎症性疾病中所见，如家族性地中海热、Blau综合征和与炎症体相关的周期性综合征（CAPS），这些疾病与炎症体相关基因的功能增强突变有关，导致促炎细胞因子IL-1β和IL-18的增加。相比之下，越来越多的证据表明IBD可能由功能丧失突变引起。实际上，先天免疫反应的缺陷，包括肠道上皮屏障的缺陷，是导致对肠道微生物群变化控制受损和适应性免疫系统激活的原因，促进了导致慢性炎症和组织损伤的次级炎症反应。例如，NOD2的功能丧失突变，它编码一种细菌壁组分的先天免疫传感器，与克罗恩病有关，而同一基因的功能增强突变则导致Blau综合征。中性粒细胞是肠道先天免疫的关键角色。中性粒细胞渗入肠道粘膜是活动性IBD的标志，主要的粪便疾病活动性生物标志物是中性粒细胞颗粒蛋白，包括卡尔保护蛋白。在2022年，检测到针对粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（aGMAbs；也称为抗GM-CSF抗体）的自身抗体被证明可以预测复杂性克罗恩病的回肠部分，远在疾病诊断之前。此外，aGMAbs影响了包括中性粒细胞在内的髓系细胞的相对丰度，并促进了1组先天淋巴细胞（ILCs），导致肠道免疫稳态的扰动。GM-CSF是巨噬细胞极化的关键调节因子，也是中性粒细胞产生和功能的关键调节因子，这加强了中性粒细胞是IBD发展中心的观点，特别是在克罗恩病中（见"中性粒细胞在IBD中作用的二元性"部分）。然而，中性粒细胞在IBD中的作用和功能比其他免疫细胞类型，如T细胞，研究得少。这一领域的最新进展揭示了一个意想不到的复杂性，特别是中性粒细胞与肠道微生物群之间的精细交流，这可能导致新的治疗策略。在这篇综述中，我们讨论了中性粒细胞表型的异质性和中性粒细胞在IBD中作用的二元性。然后，我们展示了中性粒细胞、微生物群和IBD之间的多重联系。最后，我们探索了中性粒细胞与微生物群在肠道稳态和炎症中的新对话，为开发新的治疗策略开辟了有希望的途径。

IBD中中性粒细胞表型的异质性

长期以来，中性粒细胞一直被认为是具有专一抗菌活性的同质细胞群体。它们在循环中的短暂寿命和低转录活性被认为是与功能多样性不相容的。在过去5年中，中性粒细胞的可塑性已成为一个新兴的研究焦点；有越来越多的证据表明，在稳态和病理条件下，存在具有不同表型和功能的中性粒细胞群体。新认识的中性粒细胞功能包括与几乎所有免疫细胞进行交流并调节它们的能力，以及与微生物群相互作用。然而，由于分离技术的种类和分析参数的不同，研究之间存在许多差异。的确，制备方法、抗凝剂类型和样本处理的时间框架（包括去除红细胞）影响中性粒细胞的表型和激活水平。这些偏差对准确表征中性粒细胞亚群构成了重大障碍，并使得研究结果之间的比较复杂化，从而阻碍了该领域的发展。

使用密度梯度离心从血液中分离细胞，导致了正常密度中性粒细胞（NDNs）、具有促炎或抗炎特性的低密度中性粒细胞（LDNs）以及具有促肿瘤（N2）或抗肿瘤（N1）效应的肿瘤相关中性粒细胞（TANs）在癌症患者中的识别。然而，这些细胞与所有其他中性粒细胞相比的功能特异性受到了质疑。同时，根据表面标志物的表达，使用流式细胞仪对中性粒细胞进行了分类，包括CD177、嗅觉素4、CD10、CD33、CD11b/c、CD16、CXCR4、CD66b、CD63、CD62L和CD5421。CD177+的中性粒细胞被描述为在IBD中具有保护作用的新亚群。但同样，目前尚不清楚这些不同的群体是否代表中性粒细胞的实际亚群，或者是对组织环境中局部线索的不同激活或成熟状态的响应。有趣的是，正在进行反向跨细胞迁移的人中性粒细胞，即通过穿越内皮层从炎症部位返回血管系统的中性粒细胞，具有独特的表型（细胞间粘附分子1（ICAM1）高，C-X-C基序趋化因子受体1（CXCR1）低），与驻留在组织中的中性粒细胞（ICAM1低，CXCR1低）和循环中的中性粒细胞（ICAM1低，CXCR1高）相比。反向跨细胞迁移的中性粒细胞无法再次跨细胞迁移到组织中，并且具有延长的寿命和增加的产生超氧离子的能力。这一观察表明，在周围循环中存在具有独特表型和功能的组织经验丰富的中性粒细胞群体，从而有助于中性粒细胞的异质性。

基于单细胞分析的无偏方法对于理解中性粒细胞生物学和解决这些问题至关重要，但在IBD领域，数据却很稀缺。髓系分化的联合转录组-蛋白质组分析使人们对人类中性粒细胞成熟过程有了更好的理解。对来自小鼠骨髓、血液和脾脏的细胞使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）方法揭示了中性粒细胞在分化过程中逐渐获得抗菌能力。然而，细菌感染并没有影响中性粒细胞的整体异质性，突显了中性粒细胞反应的精细调节。有趣的是，血液中更成熟的中性粒细胞亚群与骨髓中更成熟的中性粒细胞亚群不同，这加强了环境线索影响中性粒细胞异质性的观点。scRNA-seq分析还探索了人类血液中性粒细胞的多样性和可塑性，发现不同的转录亚群取决于它们的成熟阶段，特别是一个具有干扰素诱导基因表达特征的“终点”中性粒细胞群体。应用于溃疡性结肠炎或克罗恩病患者的炎症结肠的scRNA-seq和空间分子成像显示，与健康对照组相比，巨噬细胞和中性粒细胞在患者组内显示出最高的细胞多样性，这可能解释了疾病发展的变异性。在固有层中的中性粒细胞，主要积聚在隐窝脓肿和溃疡区域，与其外周对应物相比，表达不同的膜蛋白标记（CD62L、CD193、CD69），表明不同的激活状态。发现了三种状态的肠中性粒细胞：N1和N3与外周中性粒细胞最相似，而N2中性粒细胞表达的基因提示不同的组织位置（例如，表达趋化因子和受体的基因）和激活状态或功能（例如，CD83和CD63）。N3中性粒细胞显示出干扰素基因特征，而N2中性粒细胞表达高水平的CXCR4，这是一种在炎症组织中高度表达的趋化因子受体。这项研究的一个限制是空间分子成像小组所使用的基因数量（Garrido-Trigo等人中的35个35个），这个数量足以覆盖大多数细胞类型，但可能缺乏N1、N2和N3中性粒细胞亚群的重要标记，它们共享大部分转录组特征。在小鼠的肺和肠道中，组织驻留的CXCR4+中性粒细胞被证明表达非免疫相关功能的转录程序，包括血管生成，这突显了中性粒细胞功能的多样性。

中性粒细胞的异质性，包括参照或标准中性粒细胞亚群或具有不同激活或成熟状态的亚群，是免疫病理生理学的一个重要特征，特别是在复杂的宿主-微生物相互作用的背景下，需要被进一步探索。

中性粒细胞在IBD中的双重作用

除了中性粒细胞的异质性逐渐显现外，它们在IBD中的作用也越来越被认为是具有双重功能的，既有有害效应也有保护效果。尽管它们倾向于引起慢性炎症和组织损伤，但它们对于维持肠道屏障、宿主防御和炎症的解决仍然至关重要。

在抵御入侵微生物的第一道防线中，大量的中性粒细胞被招募到肠道粘膜，导致上皮屏障损伤。炎症性上皮细胞释放招募信号，包括细胞因子（IL-8、IL-6、IL-33）、趋化因子（CXCL5、CXCL7、CXCL10和CCL20）、脂质介质（白三烯B4（LTB4））、肝素XA3（HXA3）和基质金属蛋白酶（MMP3和MMP7），这些信号使中性粒细胞迁移到炎症部位。中性粒细胞的跨上皮迁移与IBD和实验性结肠炎中更严重的疾病症状和隐窝结构的破坏有关，几个IBD易感基因参与了招募和/或迁移（包括编码CXCL5、CCL20、MMP9、HCK原癌基因、Src家族酪氨酸激酶（HCK）、淋巴细胞特异性蛋白1（LSP1）和肝细胞生长因子激活因子（HGFAC）的基因）。一旦被招募到肠道组织，中性粒细胞通过释放高水平的活性氧（ROS）、细胞毒性的细胞内颗粒内容物（例如，髓过氧化物酶（MPO）、防御素、溶菌酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶和水解酶）以及中性粒细胞胞外陷阱（NETs）来加剧炎症。ROS破坏细胞膜并激活氧化还原敏感的炎症途径。蛋白酶如MMPs和中性粒细胞弹性蛋白酶破坏细胞连接，导致隐窝变形和脓肿形成，这是IBD的一个标志。它们还产生促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF）和IL-1β45，以及大量趋化因子来招募自己（通过CXCL1、CXCL2、CXCL5和CXCL8）和其他免疫细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞、树突状细胞和T细胞，特别是通过CCL2。除了它们的抗菌效应外，中性粒细胞产生的α-防御素48和卡尔保护蛋白进一步增强了中性粒细胞、单核细胞和T细胞到炎症部位的招募。因此，中性粒细胞的积累放大了免疫反应，导致更多的粘膜损伤。此外，NETs在结肠组织和血浆中的沉积增加了活动性IBD中静脉血栓栓塞的风险，但这也已被证明通过免疫性血栓形成在溃疡性结肠炎小鼠模型中防止出血。

尽管中性粒细胞具有促炎和破坏潜力，但它们对肠道健康至关重要，因为在结肠炎的小鼠模型中，中性粒细胞的消耗加剧了炎症。除了杀死微生物和清除碎片外，它们在肠道上皮愈合和炎症解决中的作用已得到广泛认可。特别是，CD177+的中性粒细胞在IBD中具有保护作用，因为它们表现出增加的杀菌活性，包括释放活性氧（ROS）、抗菌肽（AMPs）和中性粒细胞胞外陷阱（NETs），但减少了包括IL-6、IL-17A和干扰素-γ（IFNγ）在内的促炎细胞因子的产生，并且高产生IL-22和转化生长因子-β（TGFβ），促进组织愈合。中性粒细胞还产生血管内皮生长因子和促进解决炎症的脂质介质，如保护素D1和解决素E1，这些物质抑制中性粒细胞的招募，并增强小鼠巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的吞噬作用。有趣的是，CXCR4high的中性粒细胞可能通过释放额外的基质金属蛋白酶9（MMP9），一种调节细胞外基质重塑的蛋白酶，在肠道促进血管生成。单核细胞趋化蛋白1诱导蛋白1（MCPIP1），在IBD患者的中性粒细胞中高度表达，深刻抑制中性粒细胞的迁移和促炎活动。此外，在体内外小鼠模型中，中性粒细胞被显示为在炎症部位自我限制自己的聚集，以扫描更广泛的组织区域以寻找细菌入侵，并在组织中维持有效的稳态调节。这些观察结果表明，中性粒细胞已经进化出机制来对抗慢性炎症的恶性循环。因此，中性粒细胞充当双刃剑，理解影响它们在肠道炎症中作用的遗传和局部线索至关重要。

中性粒细胞对疾病发展的贡献在溃疡性结肠炎患者和克罗恩病患者之间是不同的。在溃疡性结肠炎中，中性粒细胞的浸润与疾病的严重程度相关。与健康对照个体相比，活动性溃疡性结肠炎患者的血液中中性粒细胞与淋巴细胞比率（NLR）增加，尽管NLR不能区分活动性和非活动性溃疡性结肠炎。与硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠模型类似，溃疡性结肠炎患者表现出NETs的释放增加和参与NETs形成的关键酶肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）的表达增加。与健康个体相比，溃疡性结肠炎患者的ROS和蛋白酶水平，包括中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3也增加。此外，与敏感患者相比，对皮质类固醇有抵抗性或对环孢素A无反应的溃疡性结肠炎患者在结肠中表现出增加的中性粒细胞积累，以及高水平的ROS、中性粒细胞弹性蛋白酶和不受控制的T细胞增殖，这表明增加的中性粒细胞浸润可能与溃疡性结肠炎患者治疗失败有关。虽然中性粒细胞的过度激活似乎是溃疡性结肠炎的核心，但在克罗恩病中，它们的功能障碍可能是一个主要的致病因素。实际上，在克罗恩病患者中，由于中性粒细胞功能受损，氧化和吞噬活动减少，以及由于驻留巨噬细胞释放较少的IL-8，导致细菌清除延迟或不完全（参考文献71-74）。组织中细菌抗原的持续存在导致肠道适应性免疫反应上调和克罗恩病中发现的肉芽肿的形成。此外，所有主要影响中性粒细胞功能的免疫缺陷，包括慢性肉芽肿病（CGD）和糖原贮积病1B型，都与类似克罗恩病的表型相关。在CGD中，中性粒细胞可以吞噬微生物，但由于NADPH氧化酶依赖的ROS产生缺陷，无法杀死它们。糖原贮积病1B型的特点是几乎持续的中性粒细胞减少，这与剩余中性粒细胞的氧化功能受损有关。再次，中性粒细胞的功能对维持肠道稳态至关重要。

这些数据表明，IBD的预防和治疗策略应该旨在调节中性粒细胞的功能，以限制它们的过度激活，而不是冒险完全消耗中性粒细胞。在这种情况下，肠道微生物群在稳态和炎症条件下对中性粒细胞功能性的影响是什么？理解IBD中中性粒细胞与微生物群的对话可能会开辟治疗这些疾病的新途径，这些疾病伴随着许多未满足的医疗需求。

中性粒细胞、微生物群和IBD：建立联系

肠道微生物群与IBD发展之间的联系现在已经清楚地被证实，并强调中性粒细胞发挥着重要作用。

肠道微生物群的改变：IBD的因和果

肠道微生物群作为IBD发病机制中的一个角色现在已经被清楚地证实。通过将IBD患者的微生物群转移到小鼠身上以及在不同小鼠遗传背景之间，以及粪便微生物群移植（FMT）在溃疡性结肠炎中的临床效果和在克罗恩病的首次试点研究中的鼓舞人心的效果，已经证明了与IBD相关的微生物群的促炎效应。

IBD与肠道微生物群组成和功能的修改有关。微生物群在健康中扮演着重要角色，其功能涉及营养、代谢、免疫发展和宿主防御。微生物群的改变既是过度炎症和反复感染的原因，也是先天免疫和适应性免疫功能障碍的后果。特别是，有缺陷的先天免疫部分无法控制肠道细菌和真菌。肠道菌群失调可能因促炎细菌的增加和缺乏具有调节功能的微生物而导致肠道炎症。在IBD的背景下，改变的微生物群以多样性丧失为特征，某些微生物（如兼性厌氧菌Enterobacteriaceae，包括粘附侵袭性大肠杆菌（AIEC））在末端回肠中富集，以及在结肠中失去了产生短链脂肪酸（SCFAs）的严格厌氧菌，包括梭菌属的Faecalibacterium prausnitzii。在小鼠中，IVa和XIV梭菌在结肠固有层诱导分泌IL-10的调节性T（Treg）细胞，这通过产生SCFAs减轻结肠炎。F. prausnitzii通过多种机制和靶点改善肠道炎症和屏障功能。因此，IBD中改变的微生物群产生更多的炎症。

人类基因组中IBD的驱动因素包括超过350个风险位点，其中许多参与控制细菌生长。有趣的是，微生物群的改变特别是在携带与宿主-微生物界面功能相关基因多态性的IBD患者中发现。系统筛查关联揭示了IBD患者中一些遗传变异的疾病风险可能由微生物组介导。这种分析发现了NOD2变异体与两个类群之间的关联：Roseburia属和F. prausnitzii物种。此外，与IBD相关的基因ATG16L1和NOD2可能在对小鼠实验性结肠炎有保护作用的Bacteroides fragilis的有益免疫调节特性中发挥重要作用。与IBD相关的基因CARD9（编码caspase募集结构域9）调节肠道微生物群的组成和功能，并促进色氨酸衍生的代谢产物的产生，特别是芳基烃受体（AhR）激动剂，这些在小鼠和人类中对肠道炎症具有保护作用。的确，除了肠道微生物种类和多样性的差异外，IBD患者和健康个体在微生物代谢途径上也呈现差异。一项包括132名个体（67名克罗恩病患者，38名溃疡性结肠炎患者和27名非IBD对照个体；随访1年，每个时间点最多24次；总共2,965份粪便、活检和血液标本）的大型多组学分析为IBD活动期间肠道微生物组的功能失调提供了全面的视角，并证明了微生物转录和代谢活动的破坏，对粪便中的乙酰肉碱、胆汁酸和SCFA水平有影响。这一观察结果证实，肠道微生物群衍生的代谢产物参与维持肠道稳态以及IBD的发病机制，并可用作失调的生物标志物，并可能成为针对IBD新治疗药物开发的目标。

中性粒细胞位于IBD和微生物群的交汇处

350多个IBD易感基因中有许多涉及与防御微生物相关的中性粒细胞功能（见图1），如病原体检测和吞噬作用（NOD2）、自噬（ATG16L1）和活性氧（ROS）产生（CYBA、CYBB、NCF4、IFNGR2）。这突显了吞噬和氧化功能在疾病发展中的重要性。还有许多其他影响中性粒细胞的多态性与IBD相关：IL18RAP和IL1R2，主要由中性粒细胞表达，它们在NLRP3炎症体下游的中性粒细胞激活中有作用；STAT3，一个转录因子，它在粒细胞生成和成熟中性粒细胞中调控不同的途径；JAK2，它编码一种能够与粒细胞集落刺激因子（G-CSF）受体结合的蛋白，这是中性粒细胞产生和功能的关键调节因子；PTAFR，诱导中性粒细胞自噬；CXCR1和CXCR2，对中性粒细胞趋化性很重要；CCL2和CCL7，它们编码由中性粒细胞产生的免疫趋化因子；LSP1和HGFAC，有助于中性粒细胞的招募；MMP9和HCK，参与中性粒细胞迁移；LRRK2，它编码一个在中性粒细胞中高度表达的炎症反应、吞噬作用和自噬的多效性调节因子；LITAF和PTK2B，分别涉及中性粒细胞颗粒的形成和脱颗粒；以及FCGR2A和FCGR3A，IgG受体基因，在中性粒细胞中高度表达。

图1 | 中性粒细胞在发展IBD样表型中的作用。在炎症性肠病（IBD）和具有IBD样表型的单基因疾病中，中性粒细胞在骨髓中的产生以及它们的多样化效应功能发生了变化。与IBD易感性相关的进程和基因用蓝色表示。与IBD样表型中性粒细胞功能障碍相关的单基因疾病和基因用红色表示。G-CSF，粒细胞集落刺激因子；ROS，活性氧。

与同事一起，我们还证明了CARD9的作用，这是一个IBD易感基因，编码一种参与宿主对真菌和细菌防御的蛋白，在中性粒细胞的凋亡和线粒体活性中，降低结肠炎的易感性。这些IBD易感基因在中性粒细胞中的表达量比其他主要免疫细胞类型（包括T细胞、B细胞、ILCs、单核细胞、树突状细胞、NK细胞、嗜碱细胞和嗜酸性粒细胞）要高，这突显了中性粒细胞功能在疾病发展预防中的重要性，特别是在宿主-微生物界面（见图2）。尽管影响中性粒细胞的原发性免疫缺陷，如CGD，更多地与结肠炎相关而不是回肠炎，但目前尚不清楚影响中性粒细胞基因的SNPs是否在多基因IBD背景下与结肠受累有相同的联系。

此外，包括慢性肉芽肿病（CGD）在内的原发性免疫缺陷，其中性粒细胞功能存在缺陷，特征是类似IBD的肠道炎症和肠道微生物群的改变（见图2）。与IBD中观察到的微生物群改变类似，一项初步研究表明，CGD患者的微生物群发生了改变，其中Ruminococcus gnavus（一种本身就与克罗恩病相关的物种）的丰度增加。这些数据证明了中性粒细胞功能缺陷、肠道微生物群改变和肠道炎症之间的关联。

图2 | 免疫细胞中IBD易感性基因的表达水平。来自RNA人类蛋白质图谱（HPA）的免疫细胞基因数据，按基因汇总，涵盖外周血单核细胞（PBMCs）中的18种细胞类型。数据基于人类蛋白质图谱版本22.0和Ensembl版本103.38。手稿中引用的重要中性粒细胞基因在热图的右侧标示。基因和细胞类型的聚类是根据K-均值方法进行的（聚类以灰色和黑色显示）。黑色和灰色条表示具有相似表达模式的细胞类型组或炎症性肠病（IBD）易感性基因组。IBD易感性基因是从Mirkov等人，2017年（参考文献125）、Sazonovs等人，2022年（参考文献117）和Liu等人，2023年（参考文献109）中鉴定出来的。CD，克罗恩病；DC，树突状细胞；MAIT，粘膜相关不变T细胞；NK，自然杀伤细胞；Treg细胞，调节性T细胞；UC，溃疡性结肠炎。

中性粒细胞与微生物群在IBD中的新型对话

大量证据支持中性粒细胞与微生物群之间存在相互作用，特别是在炎症条件下。在广泛研究了微生物群与其他免疫细胞类型在IBD中的相互作用之后，过去10年发表的研究集中在中性粒细胞上（见图3）。

中性粒细胞影响微生物群的组成和功能

为了维持肠道稳态，粘膜免疫系统依赖于对微生物群的耐受以及针对入侵者的防御机制。共生菌衍生的信号诱导了一个调节网络，抑制免疫激活。中性粒细胞，作为先天免疫细胞部分的主要效应细胞，以多种方式促进微生物群的调节。作为吞噬细胞，中性粒细胞通过防止感染期间的细菌易位和传播，直接影响微生物群的组成（见图3）。在炎症期间，中性粒细胞迁移到腔室部分，并形成有组织的腔内结构，这些结构包裹共生菌，控制它们的生长并限制它们与上皮的接触。中性粒细胞被吸引到腔室依赖于高亲和力的N-形成肽受体FPR1，这表明微生物群与中性粒细胞之间的相互作用对控制微生物种群至关重要。此外，中性粒细胞对肠道粘膜的募集依赖于中性粒细胞趋化性受体CXCR2，并由IL-17促进，IL-17是粘膜稳态中的一个核心细胞因子。有趣的是，CXCR2缺乏足以引起小鼠微生物群组成的变化。通过IL-17–CXCR2途径招募的中性粒细胞可以产生IL-22，IL-22通过诱导AMPs和IgA的产生而闻名，其在细菌控制中的作用。在稳态下，浸润结肠粘膜的产生IL-22的中性粒细胞对限制分段丝状细菌（SFB）的扩张至关重要，并在小鼠结肠炎期间有助于宿主防御和上皮的恢复。

在长期炎症的情况下，中性粒细胞的大规模和慢性浸润改变了肠道环境，特别是通过释放有毒分子（见图3）。活性氧（ROS）的产生增加了肠道腔内电子受体的数量，如硝酸盐、S-氧化物和N-氧化物，这有利于病原生物的生长，特别是如肠杆菌科种类这样的兼性厌氧细菌，正如在小鼠和人类的炎症环境中观察到的那样。例如，包括AIEC在内的致病性大肠杆菌物种利用硝酸盐通过厌氧呼吸产生能量，与严格依赖发酵的严格厌氧细菌拟杆菌门和梭菌门不同。鼠伤寒沙门氏菌（以下简称S. Typhimurium）使用ROS衍生物四硫代硫酸盐作为营养资源。此外，中性粒细胞颗粒含有大量的抗菌肽（AMPs），在遇到微生物时迅速释放。AMPs通过针对多种关键功能，在炎症期间杀死细菌，但它们也以亚致死剂量与微生物群相互作用，并调节局部免疫。有趣的是，所有主要门类的共生物种都已经发展出获得对高水平AMPs的抗性的策略，例如拟杆菌门的脂多糖（LPS）修饰。这些机制使免疫系统能够区分共生菌和病原体，并维持一个健康微生物群的稳定性和弹性。防御素和卡他细胞素是两种主要的AMPs，它们主要通过使微生物的膜渗透来抑制微生物的生长。在小鼠中，特异性敲除小鼠卡他细胞素LL-37的同源物——与猫相关的抗菌肽（CRAMP），在巨噬细胞和中性粒细胞中增加了对结肠炎和肠道微生物群组成的敏感性，变化比在肠道上皮细胞中的特异性删除更大。此外，中性粒细胞弹性蛋白酶，另一种主要的颗粒蛋白，在小鼠感染期间将卡他细胞素转化为其活性形式，这影响了微生物群的组成。

图3 | 中性粒细胞与微生物群之间的对话概述。

肠道中的中性粒细胞通过吞噬作用和产生活性氧（ROS）、抗菌肽（AMPs）（如防御素、猫肝素、钙保护素、脂质素、乳铁蛋白）以及IL-22来调节微生物群的组成。在慢性炎症条件下，这种活动可能有利于病原菌种（如鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）和致病性大肠杆菌）的生长，而损害共生菌种（如Faecalibacterium prausnitzii和节段丝状细菌（SFB））。

反过来，微生物能够通过先天淋巴细胞（ILCs）和基质细胞诱导的IL-17来促进骨髓中性粒细胞的产生，这导致产生粒细胞集落刺激因子（G-CSF），这是主要的中性粒细胞调节因子。由Clostridium scindens代谢的次级胆汁酸去氧胆酸（DCA）调节粒细胞生成。此外，Toll样受体（TLR）配体，如脂多糖（LPS）；微生物代谢产物，包括丁酸盐、乙酸盐和丙酸盐（短链脂肪酸）、吲哚（色氨酸代谢产物）、熊去氧胆酸（UDCA）和胆酸（CDCA）（初级胆汁酸）；以及微生物群诱导的肠道分子，如血清淀粉样蛋白A（SAA），已被证明可以直接成熟、激活或调节中性粒细胞功能。细胞外囊泡（EVs）、氨基酸、多胺和其他胆汁酸或色氨酸代谢产物的作用尚待探索。

中性粒细胞颗粒中的其他蛋白，如卡尔保护蛋白（S100A8/S100A9）和脂质运载蛋白2，限制了微生物必需的微量营养金属的生物利用度，有利于那些在获取这些营养方面最有效的细菌的生长。卡尔保护蛋白占中性粒细胞中可溶性蛋白的60%，它螯合锌和锰，这抑制了许多共生菌种的生长。然而，病原体鼠伤寒沙门氏菌通过产生高亲和力的锌转运体克服了卡尔保护蛋白介导的锌螯合，因此能够在炎症肠道中繁衍生息，并胜过共生微生物。作为所谓的“营养免疫”的一部分，包括中性粒细胞中的乳铁蛋白在内的各种宿主蛋白，螯合铁以维持极低的生物利用度。作为回应，细菌产生高亲和力的铁螯合剂，称为铁载体，如肠杆菌素（由所有肠道细菌分泌），这足以克服宿主在非炎症环境中的铁限制。然而，在炎症期间，中性粒细胞分泌高水平的脂质运载蛋白2，它螯合了三价肠杆菌素，从而限制了共生菌株的生长。作为回应，致病性大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌合成了一种不被脂质运载蛋白2螯合的铁载体——鼠伤寒沙门氏菌素，这在炎症条件下赋予了生长优势。有趣的是，共生大肠杆菌Nissle 1917菌株表达多种铁载体，并在炎症的小鼠肠道中胜过鼠伤寒沙门氏菌获取铁。限制中性粒细胞释放卡尔保护蛋白对于限制菌群失调很重要。已有研究表明，对接蛋白3（DOK3）对JAK2–STAT3信号通路的抑制作用可以减少卡尔保护蛋白的产生，在微生物群依赖的方式中对DSS诱导的结肠炎有保护作用。有趣的是，在小鼠结肠炎期间的综合宿主和微生物组分析显示，微生物对营养剥夺、AMP产生和氧化应激的反应增加，与宿主方面AMPs表达的增加相关，如卡尔保护蛋白。这一观察结果支持了这样的观点，即有多种共生属适应了抵抗环境压力，特别是由中性粒细胞在炎症环境中诱导的压力。

这些数据表明，在宿主-微生物界面的中性粒细胞通过各种直接和间接机制调节肠道内共生菌和病原体群体。尽管它们对维持稳态时的稳态至关重要，但它们的抗微生物武器可能会在炎症环境中放大微生物群的扰动。因此，理解调节中性粒细胞功能的微生物线索至关重要。

微生物群因素调节中性粒细胞的产生和功能

在基础条件下，微生物群通过释放多样的细菌细胞组分、分泌因子和代谢产物，影响上皮细胞和驻留免疫细胞的活性和/或功能。在IBD中，慢性炎症和失调导致粘液层的破坏，以及潜在的肠道上皮屏障的紊乱和完整性丧失，这增加了微生物群不仅与上皮细胞，还与被招募到固有层的促炎免疫细胞之间的直接接触。与其他免疫细胞一样，中性粒细胞暴露于各种微生物因素之下，这些因素影响它们的发展、招募、激活和成熟过程，特别是在炎症的肠道中，这些相互作用得到了增强。

中性粒细胞功能的调节：从激活到成熟。

肠道微生物群也影响感染部位中性粒细胞的招募和激活。在小鼠阿米巴性结肠炎中，抗生素引起的微生物多样性减少损害了中性粒细胞对肠道的招募，导致疾病易感性增加。这种招募障碍部分是由于趋化因子受体CXCR2的细胞表面表达减少，尽管中性粒细胞趋化因子的产生增加。在斑马鱼中，肠道细胞对微生物群的反应产生的血清淀粉样蛋白A构成了对中性粒细胞的系统信号，限制了它们的过度激活、炎症反应和杀菌潜力，同时增强了它们迁移到肠道和远处伤口的能力。在小鼠急性肠系膜缺血模型中，肠道微生物群以TLR4依赖的方式增强了中性粒细胞的招募，同时通过抑制NETs的形成控制了中性粒细胞的过度激活，从而防止了过度的组织损伤。一致地，肠道微生物群的消耗减少了脓毒症休克诱导后肝脏中NET的形成。有趣的是，中性粒细胞可以区分不同细菌种类的LPS；来自铜绿假单胞菌和某些大肠杆菌物种的LPS诱导了“自杀性”NETosis，与鼠伤寒沙门氏菌的LPS不同。这种选择性反应发生在无血清和无血小板的条件下，模拟了组织环境，并依赖于自噬和ROS的产生，而不是TLR4信号通路。相比之下，“生命”NETosis发生在全血中或在有血小板的情况下，被所有LPS血清型诱导。此外，一些益生菌菌株似乎有能力抑制中性粒细胞的激活。益生菌鼠李糖乳杆菌GG株抑制了丙啶单氮杂（PMA）和金黄色葡萄球菌诱导的NETs的形成，并减少了小鼠骨髓来源的中性粒细胞中ROS的产生和吞噬能力。此外，鼠李糖乳杆菌GG和动物双歧杆菌MB5减少了人中性粒细胞通过体外上皮细胞层的迁移。

肠道微生物群还通过TLR和MYD88信号通路控制中性粒细胞的成熟和老化。中性粒细胞的促炎活性，包括NETs的形成，与其在循环中的年龄呈正相关。已经遇到多种微生物信号的老化中性粒细胞，代表了一种活化的细胞亚群，其整合素CD11b和CXCR4的水平增加，后者涉及它们返回骨髓以进行清除。肠道微生物群促使中性粒细胞变得更具功能性活性，同时也控制它们的寿命，这对于维持循环中活化中性粒细胞的精细调节比例以及平衡组织损伤的风险至关重要。

微生物群衍生的代谢产物对中性粒细胞活性的调节。

在所有微生物群衍生的因子中，代谢产物在宿主-微生物群相互作用研究中被研究得最多，尽管关于中性粒细胞的数据仍然稀缺（见图3和表1）。短链脂肪酸（SCFAs）如乙酸、丙酸和丁酸通过G蛋白偶联受体（GPCRs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）发出信号，调节免疫反应。特别是，丁酸已被证明在人类巨噬细胞中印刻了一种抗菌程序。SCFAs在人类肠道腔内以毫摩尔浓度存在，而在血液中的量则低得多。在用DSS诱导的无菌小鼠结肠炎模型中，乙酸的给药减少了疾病严重程度，减少了包括中性粒细胞MPO在内的炎症介质的水平。的确，乙酸在中性粒细胞中增加了钙通量和非炎症性凋亡、活性氧（ROS）的产生和吞噬活性，同时减少了促炎受体如C5aR和CXCR2的表面暴露，所有这些都是GPR43依赖的方式。在人类中，丁酸和丙酸已被证明可以增加中性粒细胞的凋亡，与其激活状态无关，但独立于GPCRs和MAPKs，很可能是通过它们的HDAC抑制活。此外，乙酸、丁酸和丙酸都被证明可以在体外诱导健康捐赠者的外周血液中性粒细胞形成NETs。相比之下，丁酸对溃疡性结肠炎或克罗恩病患者的中性粒细胞显示出抑制作用，抑制了促炎细胞因子、卡尔保护蛋白、MPO和ROS的产生，并减少了迁移能力以及NETs的形成，这些结果在DSS诱导的小鼠结肠炎中得到了证实。在大鼠上进行的研究表明，丁酸刺激中性粒细胞在体内的迁移，并在体外减少了吞噬作用、ROS的产生和对白色念珠菌的杀灭。

除了SCFAs，其他微生物群衍生的代谢产物也影响中性粒细胞的功能。色氨酸衍生的吲哚类化合物在炎症期间具有保护作用，已被证明是人和小鼠中性粒细胞分泌的髓过氧化物酶（MPO）氯化活性的有效和选择性抑制剂，从而减少了DSS诱导的结肠炎中由于中性粒细胞过度激活导致的组织损伤。此外，未结合的胆汁酸熊去氧胆酸（UDCA）和鹅去氧胆酸（CDCA），与石胆酸和胆酸不同，能够以特定和可逆的方式减少人类成人和新生儿中性粒细胞的趋化性。在肝硬化患者中，血清中CDCA含量较高和UDCA含量较低与中性粒细胞吞噬作用的减少相关。在体外，CDCA减少了ROS的产生和吞噬作用，而UDCA对这些中性粒细胞功能没有影响。

机制研究仍然有限，但越来越多的证据指向微生物群衍生的色氨酸代谢产物、次级胆汁酸和胺对中性粒细胞的间接影响，因为它们调节细胞免疫环境。微生物群衍生的色氨酸代谢产物作为AhR配体，诱导产生具有免疫抑制作用的IL-22，特别是通过诱导Treg细胞，这可能会间接影响中性粒细胞的招募和激活。此外，微生物对胆汁酸、氨基酸和多胺的代谢也塑造了肠道微环境，特别是通过调节NLRP3和NLRP6炎症体的激活，从而限制了组织中多种促炎细胞因子的成熟和释放，包括IL-1β和IL-18，这间接影响中性粒细胞的招募和激活。直接的相互作用尚待证明，但这样的信号可能影响宿主-微生物群界面的免疫细胞动态。

未来几年可能会发现更多调节中性粒细胞功能的微生物群衍生成分。关于胞外囊泡（由非致病性大肠杆菌菌株和脆弱类杆菌等共生细菌释放）在免疫反应调节中的作用，目前所知甚少。2022年，研究显示使用肠道微生物群衍生的胞外囊泡对中性粒细胞进行“初级激活”，可在小鼠中性粒细胞中诱导炎症反应，包括TNF、IL-6、CCL2（也称为MCP1）和ROS的产生，以及增加迁移和吞噬作用。需要进一步的研究来阐明中性粒细胞-微生物群相互作用的复杂性。

前景和结论

尽管中性粒细胞在包括IBD在内的许多感染性和炎症性疾病中发挥着核心作用，但几个限制因素阻碍了针对这些细胞的治疗策略的发展。首先，研究中性粒细胞具有挑战性，因为它们在分离后几小时内就会经历凋亡，这排除了延迟分析和遗传操作的可能性。此外，没有细胞系能够再现所有主要的中性粒细胞功能。开发将干细胞分化为中性粒细胞的协议是有希望的，特别是对于遗传研究。在这种情况下，中性粒细胞生物学的各个方面，包括它们的异质性、寿命和转录活性，仍然是不确定和有争议的。迫切需要标准化分离方法，并为主要的中性粒细胞亚群定义共识功能标记。高通量技术可能是改善中性粒细胞异质性特征和理解健康与疾病中中性粒细胞生物学的关键。除了这些困难，从治疗角度针对中性粒细胞可能是一把双刃剑。当中性粒细胞缺乏时发展严重感染的潜在风险，引发了关于它们药理学抑制和/或耗竭的安全性问题。而且，由于IBD的生物学特性，可能需要在某些情况下增强中性粒细胞的功能，这可能与过度炎症的有害后果相关。此外，由于它们与其他髓系细胞（如单核细胞、巨噬细胞甚至破骨细胞）的强烈相似性，选择性地针对中性粒细胞是具有挑战性的。很少有研究，特别是一项关于急性肺损伤的研究，设计了基于抗体介导的小分子递送来增加针对中性粒细胞的治疗干预的选择性的方法。这些技术仍然是初步的，尚未在IBD领域发展。

在IBD中，针对中性粒细胞的治疗策略已经被实施，但并没有提供预期的结果，这突显了中性粒细胞在这种疾病中功能的复杂性和二元性。评估GM-CSF（在中性粒细胞产生和激活中居中心地位，但也在单核细胞分化中）的临床试验显示，在人类克罗恩病和小鼠结肠炎模型中具有有限的保护效果。的确，酵母产生的GM-CSF（沙格列霉素）在小鼠的回肠炎症和克罗恩病中改善了一些症状，但更大的试验未能达到统计显著性，可能由于安慰剂反应高和研究设计不够完善。针对IL-23–IL-17轴的生物治疗，这是G-CSF产生及其中性粒细胞产生的调节因子，已经被开发用于多种炎症性疾病。有趣的是，抗IL-17抗体（secukinumab），在牛皮癣、强直性脊柱炎和牛皮癣性关节炎中有效，但在IBD中无效，甚至可能是一个加剧因素。由于IL-17的一个关键功能是招募中性粒细胞并诱导它们的产生，这突显了中性粒细胞在控制肠道炎症中的重要性。然而，针对IL-23的策略（乌司他木单抗，抗p40）成功用于克罗恩病、牛皮癣和牛皮癣性关节炎的治疗。中性粒细胞衍生的MMP9已经在IBD的II/III期临床试验中被作为靶点，但在溃疡性结肠炎或克罗恩病中均未显示出治疗效果，可能由于这种蛋白酶在基质降解、重塑或修复中的双重作用。总的来说，这些观察结果表明，对于疾病管理，可能更好地是调节而不是抑制中性粒细胞的功能。

直接作用于肠道微生物群以调节中性粒细胞功能，与其他治疗相结合，可能是IBD的一个有吸引力的策略。通过改变IBD中的微生物群，FMT可能恢复健康的中性粒细胞-微生物群相互作用。的确，FMT在溃疡性结肠炎和克罗恩病的随机对照试验中显示出积极效果。然而，需要进行大规模的临床试验来验证其在临床实践中的应用。与FMT相关的可复制性、可扩展性和成本问题限制了其在慢性疾病中的广泛应用。饮食干预可能有助于增加肠道微生物群产生丁酸和其他有益代谢产物，以调节中性粒细胞及其相互作用的免疫细胞的活动。这种全面的方法似乎是相关的，但临床试验仍然难以进行，特别是因为饮食干预涉及多个偏见和不可控参数。在这种情况下，活体生物治疗产品（LBPs），一种含有活微生物并适用于预防或治疗人类疾病的新型生物制品，是一个令人兴奋的选择。越来越多的兴趣集中在识别特定细菌菌株上，这些菌株将有助于管理慢性疾病。

因此，针对中性粒细胞与微生物群的交叉对话似乎是一个有希望的治疗IBD的策略。展望未来，阐明中性粒细胞在宿主与微生物群相互作用中的作用，无论是在稳态还是在炎症条件下，对于开发新的方法来应对与微生物群改变相关的复杂疾病，如IBD，至关重要。