德国Becker&Hickl公司最新推出了一种快速采集的FLIM系统。这个系统包括一个检测器，四个并行的TCSPC通道和一个将光子脉冲分配到四个记录通道的路由设备。该系统的电子IRF宽度小于7ps（FWHM），时间分辨率低至813fs。HPM-100-06混合型探测器可以提供的光学时间分辨率短于25ps（FWHM）。该系统几乎没有堆积效应，并大大减少了计数损失。该系统的FLIM数据采集速度可以匹配商业扫描振镜的最快扫描速度。快速采集技术的时间分辨率与典型TCSPC系统一致，最多的时间通道数可达1024，甚至是4096。扫描的像素数可以增加到1024×1024或2048×2048像素，该系统同样适用于快速FLIM和精密FLIM应用。
快速FLIM采集技术目前正朝着越来越快采集荧光寿命成像数据的方向发展。快速FLIM技术通常仅在几个时间窗口中使用时间门控，或者在200ps或更长的时间范围内使用时间通道宽度的多通道缩放器处理。与TCSPC FLIM相比，市场上常见的快速FLIM技术的IRF宽度和时间分辨率要差得多，而且对于多指数衰减分布的分析能力有限。但是，在典型的FLIM应用中，如FRET成像或代谢成像，快速FLIM采集技术的缺陷却正是这些应用所不能容忍的。在FRET数据中，相互作用的供体部分必须与非相互作用的供体部分分开，代谢成像也是基于结合和游离NADH的衰变组分的分离。此外，典型的FLIM实验必须在低荧光团浓度和较低量子效率的荧光团上进行。从这些样品可以获得的光子数量是有限的。因此，光子效率，即达到满足用户要求的信噪比所需的光子数量，是FLIM技术的最重要参数之一。
人们普遍认为TCSPC FLIM技术提供了所有FLIM技术中最佳时间分辨率和光子效率。它也能够将数据记录到足够数量的高时间分辨率通道中，从而可以进行多指数衰减分析。TCSPC FLIM技术其他优点还包括记录多波长数据，同时记录FLIM和PLIM以数据及极快触发时间序列的能力。通常对于TCSPC技术的攻击主要集中于堆积效应导致无法同时实现高计数率和短采集时间。但是，达到堆积误差所需要的计数率比通常所认为的要高出100倍。即，可以使用同步信号10%的信号强度也不会触发堆积误差。通常被文献中引用的0.1%的值是错误的，可能来自早期不成熟的TCSPC文献。因此，在快速采集FLIM领域忽略TCSPC技术并不明智。
之前的文献中我们实现了在100到200ms的采集时间内可以获得计数率超过1MHz的128x128像素图像的TCSPC FLIM，并在约0.5秒内获得256×256像素图像。通过第一时间分析数据点中的衰减曲线，可以实现光子效率的最大化。第一时间的荧光寿命计算不仅仅实现了理想的√N信噪比，还可以快速运行在线FLIM，来达到扫描振镜的最大速率。更高计数率的TCSPC FLIM可以通过将光分成若干部分到达不同的检测器，并将信号记录在几个并行的TCSPC FLIM模块中来实现。我们已经在之前的文献中演示了这种技术。然而，需要使用光分束器和多个检测器使得这种系统使用起来不友好。因此，我们的目标是提供一种解决方案，无需使用多个检测器将光子分配到几个TCSPC模块中。
初看起来，从一个探测器向多个TCSPC模块分配光子脉冲会很容易。然而，TCSPC基于光子脉冲的皮秒级定时，以及TCSPC的时间分辨率源于这些时间以极高精度获得的事实。从一个TCSPC模块切换到另一个TCSPC模块的信号路径必然导致切换畸变。无论切换器的旋转是否独立于光子检测执行，是与光子同步还是与激光脉冲同步，切换畸变几乎不可避免地损害了TCSPC技术的定时精度和差分非线性。
我们对这个问题的解决方案如图1所示。像往常一样，来自检测器的光子脉冲通过一个恒定分数鉴别器CFD。CFD的输出脉冲具有恒定的宽度和时间，与检测器脉冲的脉冲幅度无关。来自CFD的脉冲控制四路路由，将脉冲分配给四个TCSPC模块。来自CFD的每个光子脉冲将路由旋转一个位置。解决方案的秘诀在于，每个光子都将路由设置为下一个光子，而不是自身。为此，光子脉冲通过延迟线。每个光子在切换动作完成后的很短时间到达路由。换句话说，光子将路由置于自身之前。当然，在图1所示的电路中也会出现切换畸变。但是有一个重要的细节：由于每个光子脉冲在路由动作后的固定时间到达路由，光子脉冲和路由畸变的总和对于所有光子是相同的。它也独立于激光脉冲周期中的光子时间。因此，路由对光子定时没有影响。
图1：'光路由'。每个光子将信号路由的位置向前移动一个位置。它在切换动作完成后不久就到达光路由，然后进入下一个TCSPC模块。由于路由组和路由到达之间的时间是恒定的，所以切换畸变对光子定时没有影响。
随着光子到达，每个TCSPC模块记录四分之一的光子。计数损失（通过检测前一个死区时间内的光子）因此大大减少。由于光路由调节光子到达时间，这个系统的改进比具有四个独立检测器的系统更大。光子之间的短时间间隔因此变得不太可能。
光路由的第二个效果是减少了可能的堆积错误。与具有四个检测器的系统相比，堆积减少量更大。如果在前一个激光脉冲周期内检测到新的光子，则它会进入下一个TCSPC模块。因此这个系统不存在任何堆积失真。只有在同一激光脉冲周期内检测到四个以上的光子时，才会出现堆积错误。TCSPC中常用的激光器重复频率为50至80MHz，在一个重复周期内超过四个光子的检测极不可能。
光路由的另一个优点是它独立于TCSPC模块工作。TCSPC模块无需反馈或“准备好”信号。因此该器件可以构建为TCSPC四模块封装的简单扩展盒。从表面上看，它与常用的网络路由器有相似之处。然而，与网络路由器不同的是，它不会将多个探测器的光子聚集在一个TCSPC模块中，而是将一个探测器的光子分配到四个TCSPC模块中。
为了演示系统的性能，我们用SPC-154N四通道TCSPC结合bhDCS-120共焦扫描FLIM系统。我们得到的128×128像素和1024个时间通道的FLIM图像如图2左侧所示。在DCS系统的单次扫描中，图像采集时间为100ms。寿命图像由SPCM软件的在线FLIM功能计算。整个图像的平均计数率约为12MHz，峰值计数率肯定超过20MHz。5x5像素区域的衰减数据如图2中所示。在整个扫描区域的衰减曲线如图2右所示。
图2：Convallaria样品的快速采集FLIM结果。采集时间100ms，128x128像素，1024个时间通道，时间通道宽度12ps。寿命范围1ns（红色）至2.5ns（蓝色）。中间和右侧：5x5像素区域的衰减曲线和整个图像的衰减曲线。
图3是以256×256像素和250ms采集时间记录的图像。因为采集的像素数量是四倍，但是采集时间只有2.5倍，每一个像素包含的光子比图2少。然而，我们依然可以获得合理的寿命图像。
图3：Convallaria样品的快速采集FLIM结果。采集时间250ms，256x256像素，1024个时间通道，时间通道宽度12ps。中间和右边：4x4像素区域的衰减曲线和整个图像的衰减曲线。
图4和图5显示了1024x1024像素的高分辨率图像。样品是来自Invitrogen的BPAE细胞载玻片。整个扫描的平均计数率为6MHz，峰值计数率约15MHz。图4记录在扫描仪的一个单帧中，采集时间为2秒。即使在这短时间内，也记录了合理的FLIM图像。（请注意，寿命范围仅为400ps宽）。
图4：BPEA样本的快速采集FLIM，1024*1024像素1024个时间通道，采集时间2秒。
图5：BPEA样本的快速采集FLIM，1024*1024像素1024个时间通道，采集时间10秒。
图6：图5所示数据的衰减曲线。左图：10x10像素点的衰减数据。右：整个图像的衰减曲线。
采集时间为10秒（扫描仪的5帧）的图像如图5所示。10x10像素点中的衰减数据和整个图像上积分的衰减曲线如图6所示。图像和衰减曲线表明该系统能够在相对较短的采集时间内记录非凡质量的FLIM数据。
图4，图5和图6所示的数据用HPM-100-06超快速混合检测器记录。使用bh SPC-150N模块，该检测器可提供约20ps FWHM的IRF。由于BDL-SMN 488nm皮秒二极管激光器的脉冲宽度，图6中的IRF宽度约为60ps。当我们使用快速激光时，光子路由器可以获得更快的IRF。图7左图显示了PHDIS-04光路由的四个SPC150N模块的电子IRF。令人惊讶的是，各模块的IRF宽度是6.7至6.9ps，即仅比模块本身的IRF（通常6.6ps）大。
由于光路由和连接电缆中的传输时间差异，四个TCSPC通道的IRF出现轻微偏移，如图7所示。可以通过为单个TCSPC模块使用不同的TAC偏移来纠正这种偏移。通过调整模块的CFD的“Zero Cross”可以实现精确对齐。不同的Zero Cross使触发点在路由器输出脉冲的前沿上下移动，从而起到非常好的延迟调节的作用。Zero Cross中的变化对IRF宽度没有影响，因为光子微调器的输出脉冲没有振幅抖动。图7中显示了SPC-150N模块延迟对准后的IRF，图7中显示了这四个模块的组合IRF。组合的IRF仍然具有6.8ps的FWHM，比任何常用光子探测器的传播时间传播速度快得多。
图7：四个SPC-150N模块的电子IRF。之前（左）和延迟对齐之后（中）。右边显示了四个SPC-150N的组合IRF。组合IRF的FWHM为6.8ps。
用Toptica Femto Erb飞秒光纤激光器记录的整个系统的光学IRF如图8所示。
图8：使用光路由和HPM-100-06混合检测器的SPC-154N四模块封装的IRF。FWHM是22.6ps。
这里描述的快速采集 FLIM系统能够以高计数率和短采集时间记录FLIM，并且不会牺牲时间分辨率。FLIM数据仍然可以在亚皮秒时间通道和低于25ps的IRF宽度下进行记录，从而充分利用bh TCSPC FLIM模块和超快速混合检测器的时间分辨率。因此它同样适用于快速FLIM和精密FLIM应用。该系统可与bh DCS-120共焦和多光子扫描系统结合使用，也可与其他制造商的激光扫描显微镜结合使用。
References
1. W. Becker, The bh TCSPC handbook. Becker & Hickl GmbH, 7th ed. (2017). Available on www.becker- hickl.com
2. W. Becker, Advanced time-correlated single photon counting techniques. Springer, Berlin, Heidelberg, New York (2005)
3. W. Becker (ed.), Advanced time-correlated single photon counting applications. Springer, Berlin, Heidelberg, New York (2015)
4. W. Becker, V. Shcheslavkiy, S. Frere, I. Slutsky, Spatially Resolved Recording of Transient Fluorescence-Lifetime Effects by Line-Scanning TCSPC. Microsc. Res. Techn. 77, 216-224 (2014)
5. Becker & Hickl GmbH, Sub-20ps IRF Width from Hybrid Detectors and MCP-PMTs. Application note, available on www.becker-hickl.com
6. Becker & Hickl GmbH, Ultra-fast HPM Detectors Improve NAD(P)H FLIM. Application note, available on www.becker-hickl.com
7. W. Becker, A. Bergmann, C. Biskup, Multi-Spectral Fluorescence Lifetime Imaging by TCSPC. Micr. Res.Tech. 70, 403-409 (2007)
8. Becker & Hickl GmbH, Simultaneous Phosphorescence and Fluorescence Lifetime Imaging by Multi-Dimensional TCSPC and Multi-Pulse Excitation. Application note, available on www.becker-hickl.com
9. Becker & Hickl GmbH, DCS-120 Confocal Scanning FLIM Systems. User handbook, 7th ed. (2017). Available on www.becker-hickl.com
10. Becker & Hickl GmbH, FLIM Systems for Zeiss LSM 710 / 780 / 880 Family Laser Scanning Microscopes.
User Handbook, 7th ed. (2017). Available on www.becker-hickl.com
11. Becker & Hickl GmbH, TCSPC FLIM Systems for Nikon A1 Laser Scanning Microscopes. Data sheet, available on www.becker-hickl.com.
12. Becker & Hickl GmbH, Multiphoton FLIM with the Leica HyD RLD Detectors. Application note, available on www.becker-hickl.com
13. Becker & Hickl GmbH, FLIM systems for Laser Scanning Microscopes. Overview brochure (2017), available on www.becker-hickl.com.
14. Becker & Hickl GmbH, SPCM Software Runs Online-FLIM at 10 Images per Second. Application note, available on www.becker-hickl.com
15. W. Becker, A. Bergmann, G. Biscotti, K. Koenig, I. Riemann, L. Kelbauskas, C. Biskup, High-speed FLIM data acquisition by time-correlated single photon counting, Proc. SPIE 5323, 27-35 (2004)
16. V. Katsoulidou, A. Bergmann, W. Becker, How fast can TCSPC FLIM be made? Proc. SPIE 6771, 67710B-1 to 67710B-7 (2007)