Cobolt激光器助力斯坦福大学团队实现活细胞无标记成像突破

——无需染料，120nm分辨率，极低光毒性，开启活细胞成像新篇章

近日，斯坦福大学W. E. Moerner教授团队在《Light: Science & Applications》期刊发表了一项突破性研究成果——干涉图像扫描显微技术（iISM）。该技术首次将干涉散射显微镜与图像扫描显微术相结合，在活细胞内部实现了约120nm的横向分辨率，同时将所需照明功率降低至传统方法的十分之一。值得一提的是，该项研究中使用的445 nm激光器，正是来自Cobolt公司。

从“有毒”的荧光到“温和”的无标记成像

在生命科学领域，光学显微镜是不可或缺的研究工具。传统荧光成像虽然能够清晰地标记特定分子，但荧光染料的引入常常伴随着光毒性、标记效率受限以及对生物功能的干扰等问题。多年来，科学家们一直期待一种能够在不损伤活细胞的前提下，依然保持高分辨率和高对比度的成像方法。

干涉散射显微技术（iSCAT）的出现为这一目标提供了可能。该技术通过检测纳米结构对光的散射信号，无需任何染料或遗传标记即可实现高灵敏度探测。然而，将iSCAT应用于活细胞成像面临一个核心挑战：细胞内部复杂的异质结构会产生散斑噪声，严重降低图像质量。此前虽有研究通过共聚焦照明和探测方案在一定程度上解决了这一问题，但成像所需的光照功率仍然较高，制约了其在敏感细胞样本上的应用。

iISM：三项技术的巧妙融合

Moerner教授团队开发的干涉图像扫描显微技术（iISM），巧妙地将三项关键技术融为一体：干涉散射检测提供无标记对比度，图像扫描显微术提升分辨率，以及研究团队专门开发的适应性强像素重分配算法（APR）处理相干信号。

干涉型介质散射显微（iISM）原理。图 a 为成像扫描显微镜结构示意图。组件包括：OBJ物镜、TL管状透镜、FM翻转镜、SL扫描透镜、 PBSC 偏振分束立方体、EF发射滤光片、IL成像透镜、CON聚光镜、FC光纤耦合器、PM SMF保偏单模光纤、S快门。黑色箭头标示机械运动自由度。图b为60纳米聚苯乙烯纳米颗粒在1天文单位处线偏振光下的照明点扩散函数（PSF）与检测点扩散函数（iPSF）的并排对比；图c为圆偏振光下的对应结果。坐标xd、yd分别表示相机传感器平面，xs、ys表示样品平面。图d为对应开针孔与闭针孔共聚焦iSCAT图像的iPSF结果（详见正文）；闭针孔图像低光照条件下的条纹图案源于激光功率调制与电流扫描频率的混叠效应（详见图S8）；图f为采用自适应像素重分配（APR）技术后的iISM所得iPSF，入射光功率与检测光子数保持一致；图g为d–f所示三种配置下iPSF的线性分布曲线：1.9天文单位（蓝色）、0.15天文单位（绿色）及iISM-APR处理后（红色）。单位：Airy单位（AU）；所有比例尺均为200纳米。

这套系统的核心光源正是Cobolt MLD-06-01型445 nm二极管激光器。在整个实验过程中，该激光器为系统提供稳定的445 nm照明光，经过单模光纤空间滤波后，通过偏振分束器和四分之一波片转换为圆偏振光，最终聚焦到样本平面。研究团队之所以选择圆偏振光，是因为其能够在高数值孔径条件下提供更好的旋转对称性，这直接关系到最终成像的分辨率和信噪比。论文中的实验数据清晰表明，采用圆偏振光后，照明点扩散函数的各向同性得到显著改善，为实现精准的像素重分配奠定了光学基础。

活细胞内细胞器的清晰呈现

凭借iISM技术，研究团队成功实现了对COS-7活细胞内多种细胞器的无标记成像，包括内质网、线粒体、囊泡、肌动蛋白细胞骨架、质膜以及片状伪足等结构。这些细胞器在图像中清晰可辨，而且有趣的是，同一类型的细胞器可能呈现出正对比度或负对比度，这反映了它们相对于光学切面的微小轴向位置差异，体现了iISM对纳米级三维形貌的固有灵敏度。

固定 COS-7 细胞中肌动蛋白细胞骨架的关联干涉散射显微镜 (iISM) 与荧光干涉散射显微镜成像 a. 细胞的无标记 iISM 图像，显示出延伸的丝状肌动蛋白结构。 b. 同一视野下 Alexa Fluor 647 标记肌动蛋白的荧光 ISM 重建图像。 c. a 与 b 的叠加图，展示了两种成像模式之间的空间对应关系。比例尺 a-c：15 微米。 d-f. c 图中白色虚线框区域在两种成像模式下的放大图。青色箭头（从左至右）分别标示了从细胞伸出的丝状伪足尖端、因相对轴向位置不同而呈现相反对比度的两条肌动蛋白纤维束，以及一个黏着斑。比例尺 d-f：2 微米。 g. 沿 d-f 图中青色虚线的线轮廓图，显示肌动蛋白荧光信号（红色）与 iISM 干涉对比度信号（黑色）的共定位情况。

在时间序列成像中，研究团队以约8.2秒每帧的速度连续记录了囊泡运动和内质网重塑的动态过程。红色箭头标记的囊泡在细胞质中迁移，内质网小管发生动态重组，这些精细的生物学过程均在无标记、低损伤的条件下被忠实记录。值得注意的是，iISM成像的帧率仅受相机读取速度的限制，不存在荧光光物理上限的约束，这为其在快速动态过程研究中的应用打开了广阔空间。

研究团队还进一步验证了iISM与荧光成像的互补性。在固定细胞实验中，他们分别获取了同一区域的iISM无标记图像和Alexa Fluor 647标记的肌动蛋白荧光图像，叠加结果显示两者具有极好的空间对应关系。更有意义的是，iISM图像还揭示了一些荧光通道中不可见的未标记结构，如黏着斑和相邻囊泡，凸显了无标记散射对比度所提供的额外结构信息。

对于现有的商业共聚焦荧光IS显微镜系统，iISM可通过相对简单的光学改造实现：将主二色镜替换为偏振分束器，并在光路中加入四分之一波片即可。这意味着该技术具有较低的转化门槛，有望快速进入商业应用阶段。从更广阔的视角来看，研究者展望了将iISM与单分子荧光IS显微镜结合的混合策略。这种策略有望将超灵敏散射检测与分子特异性融为一体，为细胞结构和功能研究提供前所未有的信息维度。

Moerner教授团队的这项研究，标志着无标记活细胞成像技术迈出了重要一步。通过将干涉检测与图像扫描显微术创造性地结合，iISM在保持约120纳米高分辨率的同时，将照明功率需求降低至传统方法的十分之一，实现了真正意义上的低损伤、长时间活细胞观察。在这一突破性系统中，Cobolt MLD-06-01激光器凭借其稳定的性能和优异的输出质量，为核心实验提供了可靠的光源保障，助力科学家们在近乎天然的生理条件下，窥见细胞内纳米尺度的动态世界。

Cobolt激光器

在这项研究中，研究团队选择了Cobolt MLD-06-01 150mW 445nm二极管激光器作为系统的照明光源。这一选择并非偶然，而是基于Cobolt激光器在多方面的卓越性能。

精准波长输出：445nm的蓝色波长在生物成像中具有独特优势。这一波长能够有效穿透细胞组织，同时减少光毒性，特别适合长时间活细胞观察。Cobolt激光器提供的稳定445nm输出，确保了实验的一致性和可重复性。

优异的稳定性：论文中提到，为了减少激光相干伪影和抑制强度波动，激光驱动电流在采集过程中被连续调制。Cobolt激光器的高稳定性特性在这一应用中发挥了关键作用。根据产品资料显示，Cobolt激光器采用HTCure™高温固化工艺，8小时长期功率稳定性可达±0.5%，为精密实验提供了可靠保障。

低噪声特性：在干涉成像中，激光噪声会直接影响成像质量。Cobolt激光器的低噪声特性（RIN值低至-140dB/Hz）为高对比度成像提供了纯净的光源基础。研究团队能够获得清晰的细胞内器图像，与激光器优异的噪声性能密不可分。

紧凑设计与易集成性：Cobolt 06-01系列采用即插即用设计，集成驱动与温控，支持光纤耦合输出，大幅降低了系统集成难度。这一特点使得研究团队能够将激光器轻松整合到复杂的显微成像系统中。

在成像过程中，研究团队通过调制激光驱动电流来降低相干噪声，并对激光功率进行精确控制，使得到达样本平面的照明功率仅为约0.5mW。

这一数值相比此前文献报道降低了约一个数量级。如此低的功率水平，意味着在成像过程中几乎不会对活细胞造成可观察的光损伤，理论上可以实现无限长的观察时间而不损害细胞完整性。在实验中，研究团队也确实观察到了这一点：细胞在持续成像过程中保持良好状态，细胞内细胞器的动态行为可以被连续追踪。

对于Cobolt激光器而言，这一应用场景对其性能提出了严苛要求。iISM技术的核心优势之一是将封闭针孔的高分辨率与开放针孔的高信噪比兼得，而这一效果的高度实现依赖于照明光的高质量和稳定性。实验结果表明，系统的对比度噪声比（CNR）从封闭针孔配置的10提升至iISM配置的38，提升了近四倍，比开放针孔配置也高出约三倍。这一显著性增强直接转化为活细胞成像质量的飞跃。

参考论文：《Interferometric Image Scanning Microscopy for label-free imaging at 120 nm lateral resolution inside live cells》 Light Sci Appl (2026).https://doi.org/10.1038/s41377-026-02210-y