自1970年Martin Evans等人由小鼠胚囊中首次分离获得小鼠胚胎干细胞并成功的在体外进行培养以来[1]，干细胞的研究越发深入，且有关干细胞的研究百花齐放，干细胞相关研究逐渐成为热点话题。
人的胚胎干细胞的体外培养在1998年由美国科学家James Thomson首次培养成功[2]。此后，围绕人胚胎干细胞的相关项目逐渐开展，但是，人胚胎干细胞十分难以获取，导致干细胞研究虽然热门，但依旧不能广泛研究，直到2006年日本科学家山中伸弥（Shinay Yamanaka）团队重编程生成了诱导多能干细胞[3]。这一研究发现，解决了干细胞研究材料稀少不足以广泛应用的问题。
迄今为止干细胞相关研究逐年递增，干细胞的培养条件相对于常规实验细胞的培养条件来说更加严苛，因此在整个干细胞的培养过程中需要有严格的操作流程及注意事项。本文将详细叙述多能干细胞的培养操作流程。
1.1 基质胶铺板、孵育及平衡
在6孔板/12孔板内，每孔加入1mL/0.5mL基质胶，均匀铺平皿底，在37℃，5%二氧化碳培养箱中孵育1-2小时，实验前在超净工作台中室温下平衡20分钟（或2-8℃静置过夜）。
（注意：干细胞复苏过程中的基质胶铺板数由冻存细胞密度决定，一支冻存的干细胞的密度在1×106cells/mL左右，需要6孔板铺1孔或12孔板铺2孔基质胶）
1.2 实验试剂平衡
干细胞培养基在实验前置于室温中避光平衡30-60分钟。
1.3 超净工作台照射紫外
1.4 恒温水浴锅准备
2.1 准备
细胞复苏前需在15mL离心管中加入10mL基础培养基备用。
2.2 复苏
将冻存管从液氮罐中取出，快速进入37℃水浴锅中，快速摇动，使其在1-2min内快速解冻。
2.3 离心
解冻后吸出冻存管内冻存液及细胞移至准备好的含有基础培养基的15mL离心管中，配平后，1000 rpm/min离心3min。
2.4 重悬
离心后弃上清加1mL干细胞培养基对干细胞沉淀进行吹吸混匀。
2.5 接种
将已经平衡好的基质胶弃掉，缓慢吹吸离心管中的细胞悬液，待细胞悬液混匀后，加入到6孔板/12孔板中铺胶的孔内，补全每孔2mL/1mL的培养体系。
2.6 培养
接种后的6孔板/12孔板置于倒置相差显微镜下观察接种的干细胞密度以及细胞团块大小，呈4个细胞以上的团块较合格，水平十字轻轻晃动6孔板/12孔板使细胞均匀分布。并置于37℃，5% CO₂的恒温培养箱培养，第2天观察细胞贴壁情况。
2.7 换液
1.1 实验试剂平衡
干细胞培养基、干细胞消化液以及PBS缓冲液在实验前置于室温中避光平衡30min-1h。
1.2 超净工作台照射紫外
2.1 清洗
拿出6孔板/12孔板弃去旧的干细胞培养基，贴壁缓慢加入2mL/1mL PBS缓冲液并轻轻晃动，然后沿培养皿边缘吸去PBS缓冲液。
2.2 消化
在6孔板/12孔板中加入2mL/1mL干细胞消化液使之覆盖皿底，消化2-5min。
2.3 吹打
吸掉干细胞消化液后，立刻加入平衡好的1-2mL干细胞培养基，用移液枪扇形吹打培养皿底，使皿底贴附的干细胞集落脱落，制成干细胞悬液，并将其并转移到15mL离心管中。
2.4 离心
待皿底的细胞全部吹下并移入15mL离心管后，将15mL离心管置于低速离心机中配平，1000 rpm/min离心3min。
2.5 重悬
离心后弃上清，加入1mL干细胞冻存液对干细胞沉淀进行吹吸混匀，将其加入到1.8mL冻存管中。
2.6 记录
在冻存管上标记冻存细胞种类、时间、操作者及细胞批次。
2.7 -80℃冰箱平衡
2.8 液氮冻存
冻存管置于 -80℃冰箱过夜后，第2天将其置于液氮中进行长期保存。
上述内容详细概括了多能干细胞培养流程，但是在干细胞的试剂培养过程中仍然会存在各种各样的问题需要依据实际情况解决。干细胞的领域，除胚胎干和iPSC还有多种装箱多能干细胞，在后续内容里将会逐一介绍。
[1] 马丁·约翰·埃文斯_百度百科 (baidu.com)
[2] James Thomson（细胞生物学家）_百度百科 (baidu.com)
[3] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006 Aug 25;126(4):663-76. doi: 10.1016/j.cell.2006.07.024
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