干细胞系列小知识（XXII）

1. 细胞培养

(1) 使用细胞消化液将胚胎干细胞（hESC）细胞分离成单细胞悬液，在5.5 ml hESC培养基中添加10 ng/ml activin A和10 ng/ml heregulinB，以每孔5.5×10⁶个细胞的密度在6孔悬浮板中进行计数和接种。

(2) 在摇床培养箱中以100 rpm的转速在37°C和5% CO₂下孵育，诱导三维球体形成。

(3) 24小时后，将球收集在50 ml离心管中，离心，PBS洗涤一次，重悬在第1天的培养基中。

(4) 将第1天培养基中的重悬球分散到新鲜的6孔悬浮板中，每孔5.5 ml培养基。此后，每天更换培养基至第3天。

2. 细胞分化

从第4天到第20天，去除4.5 ml培养基并添加5ml新鲜培养基。培养基组成如下:

(1) 第1天

RPMI含0.2% FBS、1:50000 ITS、100 ng/ml activin A、50 ng/ml WNT3a

(2) 第2天

RPMI含0.2% FBS、1:2000 ITS、100 ng/ml activin A

(3) 第3天

RPMI含0.2% FBS、1:1000 ITS、2.5 μM TGFBI IV、25 ng/ml KGF

(4) 第4-5天

含0.4% FBS、1:10000 ITS、25 ng/ml KGF的RPMI

(5) 第6-7天

DMEM加25 mM葡萄糖、1:100 B27 、3 nM TTNPB

(6) 第8天

DMEM加25 mM葡萄糖、1:100 B27、3 nM TTNPB、50 ng/ml EGF

(7) 第9-11天

DMEM加25 mM葡萄糖、1:100 B27、50 ng/ml EGF、50 ng/ml KGF

(8) 第12-20天

DMEM培养基中加入表1所示试剂

表1. 第12-20天胚胎干细胞分化胰岛细胞培养基添加剂

(9) 第20天

收集微球，细胞解离也短时孵育，分离成单细胞进行流式细胞术检测。活的高GFP细胞在Aria II上以低流速分选，并在微孔板中以每团1000个细胞的密度在含有表2所示试剂的CMRL培养基中重新聚集。

表2. 胚胎干细胞分化胰岛细胞第20天培养基添加剂

(10) 第22-23天

将重新聚集的增强细胞簇从微孔板转移到震荡培养箱中，以100 rpm的速度放置，并进一步培养长达两周。重新聚合后每隔三天换液^[1,2]。

1. 将间充质干细胞用不含Mg²⁺和Ca²⁺的DPBS冲洗，然后用细胞消化液在室温下消化。

2. 分离的单细胞用低糖无血清人MSC培养基冲洗，300 g离心5 min。

3. 将得到的细胞颗粒在相同的培养基中重悬，以1×10⁵个细胞每平方厘米的密度接种于基质胶包被的培养皿中。

4. 培养基微无血清DMEM-LG，添加100 ng/ml activin-A、3 μM CHIR99021、100 nM wortmannin和1%减胰岛素B-27。培养48小时。

5. 将细胞在含有100 ng/ml activin-A、3μM CHIR99021和1%减胰岛素B-27的DMEM-LG中培养2天，然后在添加55 nM trichostatin-A的无血清DMEM-LG中培养过夜。

6. 接下来的12天，细胞在高糖人间充质干细胞培养基中培养，培养基中添加10 mM烟酰胺、10 nM胰高血糖素样肽-1、10µg/L PRDX6蛋白和0.1 nM Exendin-4。

7. 培养基每三天更换一次

8. 最后用细胞消化液处理细胞

9. 将得到的单细胞悬液用相同的培养基在超低贴壁培养皿中接种3天^[3]。

1.细胞培养

使用细胞解离液将贴壁的hCiPSCs（化学诱导重编程人多能干细胞）分散成单个细胞，用DMEM/F12冲洗，在基质胶包被的细胞工厂上以每平方厘米约1.35×10⁵个细胞的密度接种于添加10 μM Y27632的干细胞培养基中。在接种24 h后开始分化。各阶段的培养基配方如下:

2.第1阶段(4天)

(1)第1天：人微血管内皮细胞(HMVEC)减血清补充培养基添加表3所示成分。

表3. iPSC分化胰岛细胞第1阶段第1天培养基添加剂

表4. iPSC分化胰岛细胞第1阶段第2-4天培养基添加剂

3.第二阶段（2天）

人微血管内皮细胞(HMVEC)减血清补充培养基中添加表5所示成分。

表5. iPSC分化胰岛细胞第2阶段培养基添加剂

4.第三阶段（4天）

DMEM培养基中添加表6中所示试剂。

表6. iPSC分化胰岛细胞第3阶段培养基添加剂

5.准备工作

细胞用DMEM培养基冲洗，以300 g的速度离心3分钟。然后将细胞以5×10⁶个细胞每孔的密度接种于添加了10 μM Y27632的第四阶段培养基的6孔微孔板中，以300 g的速度离心5分钟，将细胞旋转到微孔底部。然后将细胞在37℃的5% CO₂的在第三阶段结束时，将细胞分散，用细胞解离液在37℃下孵育6至8分钟。将释放出来的培养箱中孵育20小时。将生成的细胞团转移到含有第四阶段培养基的超低附着六孔板中。悬浮聚集体在培养摇床中培养，在37℃，5% CO₂和85%湿度下，转速为90转/分。

6.第4阶段（5至6天）

DMEM培养基中添加表7所示试剂。

表7. iPSC分化胰岛细胞第4阶段培养基添加剂

7.第5阶段（6天）

从第5阶段第1天开始，在DMEM培养基中添加表8所示试剂。

表8. iPSC分化胰岛细胞第5阶段培养基添加剂

8.第6阶段(2-4天)

DMEM培养基中添加表9所示试剂^[4]。

表9. iPSC分化胰岛细胞第6阶段培养基添加剂

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[1] Nair GG, Liu JS, et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nat Cell Biol. 2019 Feb;21(2):263-274. doi: 10.1038/s41556-018-0271-4.

[2] Gopika Nair, Matthias  Hebrok, Holger  Russ et al. Rapid generation of functional mature pancreatic islet-beta cells from human pluripotent stem cells, 03 February 2019, PROTOCOL  available at Protocol Exchange [https://doi.org/10.1038/protex.2018.140]

[3] Ghoneim MA, Gabr MM, et al. Transplantation of insulin-producing cells derived from human mesenchymal stromal/stem cells into diabetic humanized mice. Stem Cell Res Ther. 2022 Jul 26;13(1):350. doi: 10.1186/s13287-022-03048-y.

[4] Du Y, Liang Z, et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nat Med. 2022 Feb;28(2):272-282. doi: 10.1038/s41591-021-01645-7.