背景
近期国内外的干细胞研究获得不少关键性进展，其中间充质干细胞(MSCs)相关的研究数不胜数。MSC是一类具有自我更新和多种分化潜能的成体干细胞，来源于胚胎发育早期的中胚层未成熟的胚胎结缔组织。
1968年德国科学家Frieden Stein在骨髓中首次发现了MSC[1]，后来研究者陆续在全身多种组织如脂肪、脐带、牙髓中分离出了MSC。1999年，《科学》杂志首次报道了Pittenger等科学家在体外成功诱导了骨髓MSC分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞[2]。此后，科学家又陆续成功诱导MSC分化成为肌肉、韧带、肝、心肌和内皮等多种其它细胞[3]。
间充质干细胞成骨成脂成软骨分化结果染色图[2]
目前，MSC的鉴定主要通过形态学观察、表面标志物检测以及多系分化潜能鉴定。这里的多系分化潜能通常指成骨、成脂和成软骨分化，称为MSC的三系分化[4]。截至目前，MSC的三系分化已被广泛应用于鉴定，其诱导过程也相对完善，本文将简要介绍间充质干细胞三系分化中的成骨诱导分化。
间充质干细胞成骨分化
干细胞经过多个阶段才能分化成为骨细胞。其过程为：确定性骨祖细胞、前成骨细胞(preosteoblasts)、过渡型成骨细胞(transitedosteoblasts)、分泌型成骨细胞(secretiveosteoblasts)、骨细胞性成骨细胞(osteocyticosteoblasts)、骨细胞(osteocytes)。干细胞向成骨细胞的分化并非是一个完全自发的过程，某些细胞因子或生长因子起着作用。这些生物因子包括成骨氯(osteogenin)171、BMP-21T、骨生长多肽(osteogenicgrouthpeptide)、糖皮质激素(地塞米松)等。
成骨分化后茜素红染色[3]
成骨诱导分化步骤
本操作规程以六孔板培养间充质干细胞(MSC)为例：
1. 将间充质干细胞置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。
2. 当细胞融合度达到80-90%时，用0.05%细胞消化液进行消化。
3. 将消化下来的间充质干细胞按照2×104 cells/cm2 的细胞密度接种在事先包被0.1%基质胶的六孔板中，每孔加入2mL完全培养基。
4. 将细胞置于37℃，5%CO2的培养箱中进行培养。
5. 当细胞融合度达到60%-70%时，小心吸弃孔内培养基，向六孔板中加入2mL间充质干细胞成骨诱导分化完全培养基(以DMEM高糖培养基为基础培养基，加入终浓度10% 胎牛血清、1%青霉素-链霉素、200μM 抗坏血酸、10mM β-甘油磷酸盐、100nM 地塞米松)。
6. 每隔3天换用新鲜的MSC成骨诱导分化完全培养基(使用前需预热至37℃)。
7. 诱导2-4周后，根据细胞的形态变化及生长情况，用茜素红进行染色。
注意：为防止成骨细胞脱落，建议在成骨过程中出现大量钙结节之后，换液形式变为每两天一次半量换液。
成骨细胞鉴定
活跃的成骨细胞为梭形、锥形或立方形，胞浆嗜碱性，核位于细胞一端，核仁明显，表面有短的突起与相邻细胞连接[5]。通过电镜可看到胞浆内具有典型的蛋白合成结构丰富的粗面内质网及核糖体，高尔基体也较发达。成骨细胞分泌基质中的定型成分主要是V型胶原，是钙盐沉积和细胞附着的支架，无定型成分为骨钙素、骨结合素、骨桥素、纤维粘连蛋白和一系列生长因子[6]。成骨细胞可通过基质小泡释放钙离子和AFP等物质，钙离子在AFP作用下沉积在胶原上，完成基质矿化过程。可通过免疫组化和组织化学技术来检测上述指标[7]。
BMSC成骨分化过程中的线粒体变化[6]
参考文献
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