皮肤类器官构建
皮肤类器官作为一种新型的类器官模型，不仅能高度模拟皮肤组织的生理结构和功能，更好地在不同体外环境下还原较为真实的皮肤生态，还可以应用于皮肤发育研究、皮肤疾病病理研究及药物筛选等领域。三维皮肤类器官进行体外环境模拟培养，可以改善现有2D、3D模型培养细胞类型单一、缺乏细胞与ECM间相互作用、无法在体外自组织分化的局限性，缩小了与体内多细胞组织及其生理功能的差异性。皮肤类器官构建的大致流程如下。
3D皮肤模型[1]
实验材料和试剂
1. 组织培养板：选择适合细胞培养的组织培养板，常用的是6孔板或12孔板。
2. 组织培养基：选择适合皮肤类器官培养的组织培养基。
3. 生长因子：添加适量的生长因子以促进细胞的生长和分化。
4. 氨基酸和青霉素等：根据实验需求选择适合的非必需氨基酸和青霉素等添加剂。
5. 其他：超纯水、酒精、胶原酶、胰蛋白酶等。
操作步骤
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iPSC细胞诱导形成成纤维细胞
(1) 将iPSC培养在多能干细胞培养基中，调整细胞状态，至细胞汇合度达到80%。
(2) 配制iPSM培养基：DMEM中添加20%血清代替物、1% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%青霉素和4 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
(3) 使用低吸附培养板，在不含bFGF的iPSM培养基中开始诱导iPSC。并在皿中添加0.3 mM抗坏血酸、10 ng/ml转化生长因子β2 (TGF - β2）和ITS-A补充剂，诱导胚状体。
(4) 将胚状体贴于明胶包被的培养皿中，在添加抗坏血酸和20%牛血清的高糖DMEM中培养10天。
(5) 从胚状体中生长出来的细胞每周传代和培养，以获得一致的成纤维细胞。
诱导iPSC分化成纤维细胞流程[1]
2
iPSC细胞诱导形成角质形成细胞
(1) 以基质胶上的MEF为饲养层细胞，在iPSM条件下培养iPSCs一天。
(2) 将iPSCs在添加1 μM全反式维甲酸和10 ng/mL骨形态发生蛋白4 (BMP4）的无血清角质细胞培养基（DKSFM）中培养4天。
(3) 培养基改为上皮细胞培养基，分化的iPSC在培养中保持30天，以扩增和维持iPSC来源的角质形成细胞。
3
将培养的细胞接种在组织培养板上
(1) 将iPSC衍生的成纤维细胞沉积在聚对苯二甲酸乙二醇酯膜上，开始细胞聚合。
(2) 将聚合后的基质细胞孵育5-7天。
(3) 将iPSC衍生的角质形成细胞重新播种在基质上，孵育6天。
(4) 使用细胞计数器对细胞进行计数，并记录细胞的浓度和数量。
(5) 将复合培养液提升至气液界面，从下方饲喂诱导表皮分化。
(6) 按照适当的浓度和比例将生长因子添加到组织培养板中的培养基中。轻轻摇动培养基，确保生长因子充分溶解。
(7) 根据实验需求和细胞的生长情况，及时更换培养基
(8) 观察细胞的生长情况和分化状态。
(9) 根据实验需求和细胞的生长情况，调整其他试剂或药物的添加，以进一步促进细胞的生长和分化。
(10) 7天后皮肤类器官初具模型。
4
维持细胞的生长和分化
(1) 定期观察细胞的生长情况和分化状态。使用倒置显微镜观察细胞的形态、生长速度和分布情况等参数。观察细胞的生长情况和细胞形态的变化，以及细胞分化的特征和结构变化等。
(2) 根据观察结果及时调整培养条件和添加适量的生长因子，以促进细胞的生长和分化。
(3) 在调整培养条件的同时，需要注意控制生长因子的浓度和作用时间。
5
记录和分析实验结果
(1) 根据实验需求记录细胞的生长曲线、分化状态等参数。
(2) 拍摄照片或录像记录细胞的生长过程。
(3) 对记录的实验结果进行分析和研究。
利用ipsc衍生成纤维细胞生成重建皮肤[1]
注意
1. 实验操作过程中需遵循无菌原则，避免污染细胞。
2. 定期对细胞进行质量检测，确保细胞的稳定性和可重复性。
3. 对实验结果进行统计和分析，确保数据的可靠性和可重复性。
4. 操作过程中需注意安全，避免直接接触刺激性化学试剂等有害物质。
参考文献
[1] Itoh M, Umegaki-Arao N,et al. Generation of 3D skin equivalents fully reconstituted from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 2013 Oct 11;8(10):e77673. doi: 10.1371/journal.pone.0077673.
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