多能干细胞定向诱导分化为心肌细胞的研究较为深入和广泛，为心肌细胞替代治疗奠定了基础。人多能干细胞也可在一定环境下自发分化为心肌细胞。目前人多能干细胞诱导分化成心肌细胞的方法主要采用拟胚体(EB)诱导法和多能干细胞单层诱导法[1]。
多能干细胞诱导分化成心肌细胞及心肌细胞转分化[1]
EB诱导法
含血清诱导法
1. 多能干细胞传代培养至细胞状态平衡。
2. 向多能干细胞培养基中加入胎牛血清，Wnt-3a和BMP4，培养两天。
3. 向多能干细胞培养基中加入胎牛血清和BMP4继续培养两天，
4. 向多能干细胞培养基中加入胎牛血清和IWR-1培养两天[2]。
无血清分化体系
1. 向多能干细胞培养基中加入BMP4、FGF2和activinA培养4天。
2. 向多能干细胞培养基中加入VEGFA和DKK1继续培养4天。
3. 向多能干细胞培养基中加入VEGF和FGF2继续培养。
4. 最终可观察到约70%左右的EB可自发跳动。
5.在第3~5天加入小分子SB431542和dorsomorphin或在第4~10天加入Wnt信号抑制剂IWR-1均可提高分化比率[3]。
注意！
如果在分化过程中形成的EB大小不均一，则每次分化为心肌细胞的效率可能不同，不宜应用于药物筛选和细胞模型等方面。通过使用U型或V型底的96孔板可形成大小均一的EB。
WNT通路示意图[3]
单层诱导培养法
单层细胞诱导分化的技术简单，重复性好，并且细胞可与小分子化合物、生长因子等充分作用，故多能干细胞单层诱导法也受到研究者的关注[4]。
1
多能干细胞单细胞种板
(1) 多能干细胞培养至细胞汇合度在80%以上。
(2) 吸走废液PBS洗两遍。用单细胞消化液室温处理细胞，用多能干细胞培养基终止消化，再用巴氏吸管对消化的细胞轻柔吹打并转移到无菌15 mL离心管里，1000 g离心5分钟。
(3) 离心期间用吸液泵吸走4℃冰箱过夜备用的细胞培养板中的基质胶浸润混合液，并向培养板中加入完全培养基。
(4) 离心结束后吸走废液，用1 mL完全培养基重悬细胞，根据需求接种细胞与细胞培养板中，计算重悬细胞沉淀的培养液总体积。
(5) 在接种细胞时用枪尖轻柔地将细胞接种到培养板中。
(6) 根据每孔培养液总体积按1000:1的比例加入对应体积的死亡抑制剂Y，如2 mL培养基中加入2 μL死亡抑制剂Y，目的是避免种板的多能干细胞单细胞大量死亡。
2
多能干细胞诱导心肌细胞分化
(1) 将多能干细胞连续换液维持生长3~4天，当细胞生长汇合度达到90%以上时开始诱导分化；弃掉培养皿中的培养基，并使用PBS对细胞漂洗两次。
(2) 向RPMI1640培养基中加入L-AA2P、BSA和CHIR99021。
(3) 向细胞培养板中缓慢加入带有L-AA2P、BSA和CHIR99021的培养基开始分化。
(4) 显微镜下镜检拍照记录D0天细胞状态。
(5) 从第0天开始连续细胞培养48h并换液。
(6) 向RPMI1640培养基中加入L-AA2P、BSA、Wnt-3a和CHIR99021。
(7) 去掉培养皿中旧培养基，分别向每个孔中加入相应体积的步骤(6)中的培养基。
(8) 连续培养48h分化细胞。
(9) 分化至7～8天陆续开始出现小的亮黄色自发收缩团。
(10) 局部收缩团主要分布在培养皿的边缘区域，随着培养天数增加心肌细胞逐渐收缩明显。
分化生成hPSC-CMs方法的演变[5]
在过去的有关多能干细胞分化心肌细胞的研究中，研究材料逐渐由hESC转向使用hiPSC，使研究疾病相关模型、了解遗传过程和进行有效的药物筛选能力均得到了显著提高。同时，多能干细胞的培养与分化的方法也在不断完善，这些方法的开发为产生亚型特异性组织提供了基础，并扩大了对心脏病及其病因的研究和深入了解。
参考文献
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