肿瘤类器官的鉴定- 大数跨境

一米生物

2025-06-24

肿瘤类器官的鉴定

体外培养的肿瘤类器官来源于患者自体肿瘤组织，保留了原始肿瘤的组织病理学特征、遗传特征和分子生物学特征。患者来源肿瘤类器官培养成功后，需进行评估及验证以鉴定类器官是否与对应患者原始肿瘤组织具有一致性，即是否能够再现原位肿瘤的表型特征，这是后续进行类器官药物敏感性检测的重要前提。类器官的鉴定可通过HE染色、免疫组织化学、免疫荧光及基因测序等方法，从形态学、组织病理学及分子遗传学等多个维度进行评价^[1,2]。肿瘤类器官诊治平台的质量控制标准中国专家共识(2022年版)^[3]指出：肿瘤类器官的鉴定是进行药物敏感性检测的重要前提，推荐采用组织病理学方式来鉴定肿瘤类器官，以保证后续类器官药物敏感性检测结果的可信度。推荐基因测序的鉴定方式用于肿瘤类器官的基础及转化研究，暂不推荐用于类器官药物敏感性检测的临床实践服务。

在获取肿瘤类器官进行鉴定时，应尽可能保证类器官的纯净及完整性，如用类器官回收液尽可能将基质胶去除干净、分散类器官时应采用阔口移液器吸嘴或剪切移液器吸嘴以防止类器官结构被破坏等。肿瘤类器官的鉴定方法主要分为组织学鉴定和分子生物学鉴定。

1.组织形态和组织特异蛋白鉴定

类器官培养过程中其细胞自组装，并形成具有一定规则形态的3D结构。可以根据显微镜下观察到的类器官形态结构初步确定类器官的来源。例如，正常胃组织来源的类器官呈囊状和球形，由单层上皮细胞和大空腔组成；不同亚型的胃癌类器官表现为不同的形态：携带EBV基因组的胃癌类器官通常呈多层细胞组成的囊状结构，典型的肠型胃癌器官形状不规则，偶有小腔形成，弥漫性胃癌类器官则形成实心细胞簇或松散的葡萄状结构。

除直接观察外，将肿瘤组织与对应肿瘤类器官一起进行切片染色，可以观察比较它们的形态及标志物表达状态，初步判断肿瘤类器官与肿瘤组织的相似性。在形态观察方面，切片染色前，应观察类器官的生长状态，选择合适的时机进行取样(如肠道类器官的平均直径达100μm时)，和此前固定保存的对应患者肿瘤组织一起进行HE染色及免疫组化。例如，胆囊癌患者肿瘤组织及肿瘤类器官经过HE染色后，可观察到胆囊腺癌细胞形态不规则，核大深染，而正常胆囊上皮及腺瘤则表现为细胞形态较规则且排列整齐。在标志物表达状态方面，在免疫组化前，需要先筛选并确定不同瘤种的组织特异蛋白。例如，乳腺癌的标志物雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)，肠癌的增殖标志物 Ki-67、尾型同源框基因2(caudal type homeobox gene 2，CDX2)及细胞角蛋白20(cytokeratin 20，CK20)^[4]，卵巢癌的标志物包括配对盒基因8(paired box gene 8，PAX8)、P53、Wilms瘤基因1(wilm tumor genel，WT1)^[1]。组织学鉴定结果还可作为研究肿瘤异质性的线索。

Helen Yan^[5]等对胃癌类器官及其来源组织进行染色发现，类器官和肿瘤组织的蛋白质表达水平基本一致。其中，由于胃癌类器官生长速度快于组织细胞，TP53野生型类器官中p53蛋白质的表达通常高于其来源的组织，但也能够重现组织样本中p53表达水平的异质性。在3例HER-2扩增的胃癌类器官中，HER-2染色显示了与其来源组织一致的蛋白质过度表达，并且能够体现出肿瘤组织中检测到的区域异质性。采用上述形态学及组织病理学方法对类器官进行评估鉴定，具有成本低、时效快、普及性高的优势，符合类器官药物敏感性检测的时效性要求。

2.分子生物学方法鉴定

除组织形态和组织特异蛋白鉴定外，还需要更多分子水平上的证据以提高鉴定的精准度，其核心目的是验证体外培养的类器官在遗传背景上与来源肿瘤组织具有很好的相似性，可以模拟体内药物反应。传统的手段是提取DNA后进行Sanger测序和提取蛋白后进行蛋白免疫印迹(western blot)，验证关键基因在肿瘤类器官和来源组织的突变和表达水平是否一致。但是这种方法每次只能检测一种基因或一种蛋白，效率较低。随着高通量测序技术的普及应用，可供使用的方法越来越多，例如全外显子测序(whole exome sequencing，WES)、转录组测序(RNA sequencing，RNA-seq)、全基因组测序(whol genome sequencing，WGS)、目标区域捕获测序(target-seq)、DNA甲基化分析、基因表达微阵列(cDNA微阵列与DNA芯片)、基因表达系列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)等。

其中，WES凭借其全面性、有效性和极高性价比等优势，在类器官的鉴定中应用广泛。WES可发现碱基突变率、碱基突变类型占比、基因拷贝数、染色体的缺失与转位的差异，比对组织特征基因的序列，分析突变位点和类型，以及统计重叠率。研究者可依据研究的目的、费用、鉴定方法的可实施性等因素来选择适合的鉴定方法。在类器官培养的早期，基于样本采样量和成本的考虑，优先推荐HE染色和免疫组化，初步确定培养的类器官与来源组织的相似性。如果形态学验证合格，再考虑扩大培养类器官，并采样进行WES，鉴定类器官与来源组织在特征基因上的重叠率。如果研究目的需要更精准、全面的验证，可以考虑采用RNA-seq、WGS和DNA甲基化分析，专门分析某个靶点、某条信号通路或某个代谢途径的性状在肿瘤类器官中是否被保留，以供挑选符合药物筛选条件的类器官模型。若无条件进行WES、WGS等，也可采用短串联重复序列(short tandem repeats，STR)检测等验证方法以消除交叉污染对药物筛选的误导。

类器官除了可以作为研究肿瘤异质性的模型，也可被用于发现肿瘤进化的规律^[6]。例如，Helen Yan等^[5]发现胃异型增生的类器官和侵袭性胃癌类器官均涉及TP53和APC等常见早期驱动基因突变，但STK11和SMARCA4变仅存在于侵袭性胃癌类器官中，这为肿瘤进展过程的揭示提供了线索。采用基因测序对类器官进行评估鉴定，较组织病理学的评估鉴定方式具有更高的精准度，且能获得肿瘤的分子谱表达模式，从而更好地捕获肿瘤内及肿瘤间的异质性，既有助于在后续类器官药物敏感性检测中分析分子靶向药物的疗效，又有助于类器官样本库大数据的完善和建立。但基因测序存在耗时长、费用相对高，目前用于类器官药物敏感性检测方面仍有滞后性及普及性欠佳的问题。

3.肿瘤类器官的筛选

在鉴定时，类器官与其来源的肿瘤组织在特征基因上的重叠率可作为肿瘤类器官纯度的衡量指标。在利用原发肿瘤组织构建患者来源的类器官时，存在正常细胞来源的类器官潜在污染问题，往往需要采取策略以提高肿瘤类器官的纯度。由于肿瘤类器官和非肿瘤类器官形态不同，可根据镜下初步鉴定的结果手动移除非肿瘤类器官，也可以根据其密度或大小进行分离。此外，还可利用鉴定时检测到的突变对肿瘤类器官进行富集。例如，MDM2激动剂Nutlin-3可用于在混合的类器官中筛选TP53突变的肿瘤类器官^[7]，培养基中去除EGF可用于选RAS突变的肿瘤类器官^[8-10]。但针对某种突变对类器官进行选择可能会导致类器官失去异质性，故应谨慎使用该类富集方法。由于从同一肿瘤的不同克隆建立的类器官对药物敏感性可能不同^[11]，还需要通过WES、WGS或Target-seq对筛选后的类器官系和原始组织进行对比，以确认筛选后的类器官仍然具有代表性^[12]。

图1 肿瘤类器官构建及药物筛选流程^[13]

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参考文献

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2.Lee S H, et al. Tumor evolution and drug response in patient-derive organoid models of bladder Cancer.Cell, 2018, 173(2):515-528.

3.中国抗癌协会肿瘤多学科诊疗专业委员会，肿瘤类器官诊治平台的质量控制标准中国专家共识(2022年版).中国癌症杂志，2022，32(7):657-668.

4.Sachs N, et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell, 2018, 172(1-2):373-86.e10.

5.Yan H H N, et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell, 2018, 23(6):882-897.

6.Flensburg C, et al. Super Freq: Integrated mutation detection and clonal tracking in cancer. PLoS Comput Biol, 2020, 6(2): e1007603.

7.Sachs N, et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. Embo j, 2019, 38(4).

8.Van De Wetering M, et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients, Cell, 2015,161(4):933 -945.

9.Tiriac H, et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discov, 2018, 8(9):1112-1129.

10.Seino T, et al. Human pancreatic tumor organoids reveal loss of stem cell niche factor dependence during disease progression. Cell Stem Cell, 2018, 22(3): 454-467.

11.Roerink S F, et al. Intra-tumour diversification in colorectal cancer at the single-cell level. Nature, 2018, 556(7702):457-462.

12.陈晔光.类器官及其应用[M].上海科学技术出版社，2023.

13.Hu Y, et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nat Commun. 2021 May 10;12(1):2581.

公司简介

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