软骨组织属于结缔组织，其内缺乏血管、神经和淋巴系统，由细胞外基质与分散其间的软骨细胞共同构成。随着世界人口老龄化和肥胖的日益加重，软骨病变和骨关节炎发病率逐渐明显增加，全球骨关节炎患者已超过5亿，我国保守估计患者超过1亿。关节软骨损伤自我修复能力非常有限，这使得软骨相关疾病的治疗成了世界性难题[1]。使用间充质干细胞诱导其向软骨细胞分化是组织工程学的一种新的治疗方法并被逐步应用于临床[2]。
间充质干细胞成软骨分化过程涉及许多信号通路，多种影响因素可通过这些信号通路对间充质干细胞成软骨分化产生正向或负向的调控，其过程极为复杂。MSC首先收回其突起，聚集成团，这个团中间的细胞经分裂分化转变成一种大而圆的细胞，即成软骨细胞；成软骨细胞产生基质和纤维，当基质的量增加到一定程度时，成软骨细胞被分隔在陷窝内，分化为成熟的软骨细胞[3]。
1. 进行成软骨诱导分化实验之前，需要对常规消化后的细胞进行计数[4]。
2. 将3-4×105个细胞转移到15 mL离心管中，250 g离心4 min。
3. 吸去上清。加入0.5 mL预混液，重悬上一步离心所得沉淀，以清洗细胞，室温下150 g离心5 min。
4. 重复步骤3，再次清洗细胞。
5. 配置成软骨诱导分化完全培养基：完全培养基加地塞米松(10-8 mol/L)、TGF-β (10 μg/L)、维生素C (10 mmol/L)。
6. 将上一步所得沉淀用0.5 mL间质干细胞成软骨诱导分化完全培养基重悬。
7. 室温下150 g离心5 min。
8. 拧松离心管盖以便于气体交换，将其放置于37℃，5% CO2的培养箱中培养。
9. 当细胞团出现聚拢现象时（一般为24 h或48 h后，实际视细胞生长情况而定）轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中。
10. 自接种开始计算，每隔2-3天给细胞换用新鲜的成软骨诱导分化完全培养基。
11. 换液之后，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中。稍加拧松离心管盖放入37℃，5% CO2的培养箱中继续诱导培养。
12. 一般持续诱导21-28天后，可对软骨球进行福尔马林固定和石蜡包埋切片，最后进行阿利辛蓝染色。
体外诱导成软骨分化的鉴定主要围绕成软骨的标志物——Ⅱ型胶原蛋白来进行，包括通过免疫组化、Western Blot检测Ⅱ型胶原蛋白的表达和RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白的mRNA的表达，不同的角度进行鉴定；而甲苯胺蓝则主要检测成软骨细胞内酸性粘多糖[5]。
定向诱导培养完成后，用4%低聚甲醛固定细胞20 min后行以下检测。
(1) 甲苯胺蓝染色：
① 用70%乙醇、浓度为0.2%甲苯胺蓝染色1 min
② 再以95%的乙醇分色10 min，纯丙酮脱水2次
③ 每次5 min，在倒置相差显微镜下观察细胞形态
(2) 阿利新蓝染色：
(3) Ⅱ型胶原免疫荧光：
① 取6片细胞玻片用3%过氧化氢作用10 min灭活内源性过氧化氢酶
④ 甩去多余液体，滴加兔抗人Ⅱ型胶原IgG一抗，4℃过夜
⑥ 滴加生物素化山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育30 min
⑩ 滴加Hoechst33342，37℃孵育15 min
(4) PG含量检测：
② 超速离心提取葡萄糖氨基聚糖(glyco-saminoglycan，GAG)
[1] 刘少斐，许冰冰.骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及其在关节软骨损伤修复中的相关应用[J].中国比较医学杂志，2023，33(09):149-154.
[2] Bartolucci J， Verdugo FJ， et al. Safety and Efficacy of the Intravenous Infusion of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Patients With Heart Failure: A Phase 1/2 Randomized Controlled Trial (RIMECARD Trial [Randomized Clinical Trial of Intravenous Infusion Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells on Cardiopathy]). Circ Res. 2017 Oct 27;121(10):1192-1204. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.117.310712
[3] Somoza RA， Welter JF， et al. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells: challenges and unfulfilled expectations. Tissue Eng Part B Rev. 2014 Dec;20(6):596-608. doi: 10.1089/ten
[4] 谢犇，秦庆庆，杨杜斌等.骨髓间充质干细胞成软骨分化机制研究进展[J].中国运动医学杂志，2022，41(04):314-319.DOI:10.16038/j.1000-6710.2022.04.007
[5] 尹其翔，沈铁城，黄永辉.人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究[J].江苏大学学报(医学版)，2008(02):118-121+87.DOI:10.13312/j.issn.1671-7783.2008.02.007
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