背景
脂肪组织由脂肪细胞组成，对保持能量和代谢平衡非常重要。脂肪组织有两种，一种为白色脂肪组织（WAT），主要分布在皮下和内脏，内脏中的白色脂肪与肥胖、病理验证和胰岛素抵抗相关，皮下白色脂肪可以提高葡萄糖耐受性；另一种为棕色脂肪组织（BAT），主要呈离散状分布在脊椎旁、锁骨和肾上腺，主要功能是产热。这两种脂肪组织有相同的分化特征，都是由间充质干细胞（MSCs）分化而来。
间充质干细胞
间充质干细胞成脂分化
MSCs 作为成骨细胞和脂肪细胞共同的祖细胞，在多种信号调控下，其向成骨、成脂细胞的分化处于一种平衡状态。这些调控都是通过不同的信号通路来激活转录因子进而发挥作用，其中BMP、Wnt以及Hippo等信号通路在MSCs分化调控中发挥主要作用[1]。
脂肪细胞的分化是一个复杂过程，通过前脂肪细胞过度到充脂细胞再到胰岛素响应脂肪细胞。脂肪细胞分化受PPARγ、C/EBP的调控[2]。在体外培养体系中常用的 MSCs 成脂分化诱导补充剂为1 μmol/L DEX、10 μg/mL胰岛素、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）[3]。高浓度DEX能够促进脂肪生成，同时抑制成骨分化。IBMX调节C/EBPβ，单独或与DEX联合调节PPARγ活性[4]。胰岛素广泛用于诱导前脂肪细胞的增殖和分化。
间充质干细胞成骨、成脂分化机制示意图[1]
成脂诱导分化步骤
本操作规程以六孔板培养MSCs为例：
1. 将MSCs置于37℃，5% CO2的培养箱中培养。
2. 当细胞生长到达对数期时，用细胞消化液进行消化。
3. 将消化下来的间质干细胞按照2×104 cells/cm2的细胞密度接种在六孔板中，每孔加入2 mL高糖DMEM完全培养基。
4. 将细胞置于37℃，5% CO2的培养箱中进行培养。
5. 每隔三天换液，直到细胞融合度达到100%或者过融合。
6. 配置10% FBS含量的HG-DMEM培养液；
7. 在配制完成的HG-DMEM培养液中加入1 μM地塞米松，10 μg/ml胰岛素，200 μM吲哚美辛和0.5 mM IBMX；
8. 更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养2天，再用只含有10 μg/ml胰岛素的成脂维持培养液培养1天，如此交替循环培养至14天，使用油红O染色。
间充质前体细胞(MPC)和MSC体外成脂、成软骨、成骨分化染色[5]
油红O染色方法介绍：
1. 去除细胞使用的当前培养液，使用PBS清洗两次；
2. 27.5%甲醛室温固定20分钟；
3. 重蒸馏水清洗3次，空气中干燥；
4. 加入0.5%的油红O，室温孵育一小时；
5. 配制70%乙醇溶液清洗3次；
6. 倒置显微镜观察拍照记录。
成脂细胞鉴定
MSCs成脂分化的鉴定方法主要包括油红O染色法、成脂转录因子的表达以及相关成脂蛋白表达的检测等[6]。
油红O染色法是常见的成脂鉴定方法，主要是利用油溶性染料油红O对细胞内的脂肪滴进行着色以鉴定脂肪细胞的分化[7]。应用qRT-PCR技术检测成脂转录因子PPARγ和C/ EBPβ的表达也可以鉴定MSCs的成脂分化情况，相应的检测成脂标志蛋白的表达也可以鉴定成脂细胞的分化程度[8]。如应用Western blotting技术检测脂肪分化标志物PPARγ和C/EBPβ蛋白的表达；或应用ELISA检测试剂盒检测PPARγ、C/EBPβ和脂联素相关脂肪分化标志蛋白的表达；亦或是通过免疫组化方法鉴定PPARγ和 C/EBPβ蛋白的表达等[9]。
人成体干细胞脂肪分化油红O染色图[8]
参考文献
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