循环系统类器官——血管
血管是动物生命的基础，在中风、心肌梗死和糖尿病等许多疾病中起着关键作用，血管类器官的出现为众多血管疾病的研究提供了必要的研究材料。本文将对多能干细胞分化培养血管类器官的方法进行简要介绍。
hPSC聚集体的产生和分化
用0.5 mM EDTA洗涤hPSCs，去除培养基，每孔用0.6 mL 0.5 mM EDTA清洗6孔板。
弃掉EDTA溶液，每孔加入0.6 mL 细胞消化液，37 ℃孵育3-5分钟。
用P1000移液管将细胞从板上分离，轻轻上下吹吸细胞，以打破聚集体并产生单细胞。
使用5 mL移液管将细胞重悬于5 mL培养基中，并在15 mL离心管中收集细胞。
细胞计数时，将10 μL细胞悬液和10 μL 0.1%台盼蓝溶液混合，将10 μL混合液移至计数室载玻片上。
使用自动细胞计数器或在显微镜下计数活细胞。
计算实验所需的细胞悬浮体积（2×105个细胞/孔）。
300 g离心5分钟（22-23 ℃），弃掉培养基。
将细胞重悬在含有50 μM Y-27632的培养基中（每孔3 mL）。
将每孔3 mL的细胞悬液放入6孔低附着板中，孵育1天，直到形成光滑边缘（直径50-100 µm）的细胞聚集体。聚集能力因hPSC系而异，因此孵育时间可能需要从1天调整到2天甚至3天。
聚集物形成后，使用移液管将聚集物转移到15 mL 离心管中，等待聚集体在重力作用下沉淀。不要丢弃6孔板；以便以后进行重复培养。
在15 mL离心管管底部收集细胞聚集体后，小心地弃掉培养基。
使用10 mL移液管将聚集体轻轻重悬（每孔3 mL）于含有12 µM CHIR99021和30 ng/mL BMP-4的N2B27培养基中，并将聚集体转移回低附着板。
使用P1000移液器快速重悬聚集体，每天观察聚集体生长情况，以避免聚集体过度融合。培养3天诱导中胚层分化。
在第3天，将聚集体转移到15 mL的离心管中，等待它们通过重力沉淀。不要丢弃6孔板；以便以后进行重复培养。
在15 mL离心管底部收集细胞聚集体后，小心地弃掉培养基。
在含有12 µM CHIR99021和30 ng/mL BMP-4的N2B27培养基中重悬聚集体（每孔3 mL），并将聚集体转移回低附着板，再孵育2天。
步骤10和17明场图[1]
血管网络和类器官的产生
计算所需胶原I/基质胶溶液的总量，每孔使用1 mL。
将所需的材料在冰上解冻。
按上述方法用移液管移吸胶原I溶液。加入I型胶原蛋白溶液后，通过吹吸仔细混合。
用移液管将一定量的胶原蛋白I溶液移入15 mL的离心管中，并将其放在冰上。
将基质凝胶加入I型胶原蛋白溶液中，充分混合。
每个12孔板加入0.5 mL胶原I/基质胶溶液，均匀旋转板，使溶液分布在孔中。
在37 ℃下孵育2小时凝固。
用10 mL移液管将聚集体移液到15 mL管中。通过重力收集聚集体。
弃掉上清并加入1 mL 完全培养液洗涤聚集体，重复一次。
用P200移液器小心地取出所有剩余的培养基。
第二层加入I型胶原蛋白溶液。
准备好胶原I/基质胶溶液，冷藏。
将聚集体重新悬浮在基质胶原蛋白溶液中，并冷藏。
从培养箱中取出含有第一层基质胶、胶原蛋白的12孔板，并在每孔中小心地加入0.5 mL细胞聚集体-胶原I/基质胶溶液。
通过前后摇动培养皿使聚集体均匀分布，慢慢移动培养皿到培养箱。
将12孔板在37 ℃下孵育2小时，使凝胶凝固。
加入预热（37 °C） 完全培养基，含15% FBS, 100 ng/mL VEGF-A和100 ng/mL FGF-2，诱导血管分化。
埋置后1-3天应出现血管芽。
3天后更换培养基，然后每隔一天更换一次。
在第10天，进行下一步分析。
干细胞分化的血管网络和血管类器官的特征[1]
血管类器官已经广泛应用于科学研究中，但是直到现在，还没有固定的分化培养方法，从干细胞到血管类器官的形成过程还在逐步优化。在血管类器官的众多研究中还存在很多问题等待解答。
参考文献
[1]. Wimmer RA, Leopoldi A, et al. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2019 Nov;14(11):3082-3100. doi: 10.1038/s41596-019-0213-z.
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