干细胞系列小知识(XVI)

神经干细胞

1. 神经干细胞的分离

将出生24h内的新生SD大鼠脱颈处死后置于体积分数为75%乙醇中浸泡消毒15min，无菌条件下取出全脑并置于PBS培养皿中去除小脑、脑干、血管和脑膜，剪碎成糜状后加入PBS反复吹打，200目不锈钢滤网过滤。离心5min×2次(1000r/min，离心半径10cm)，去上清液，以1×10⁸/L的浓度接种培养。

2. 神经干细胞的培养及传代

将培养细胞分为常规培养组和血清预培养组。常规培养即用不含血清的条件培养基(DMEM/F12，碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27)培养，血清预培养组即先用含体积分数为10%胎牛血清基础培养基DMEM/F12(1:1)预培养(37℃，体积分数为5% CO₂，饱和湿度的恒温培养箱)4h后，改用不含血清的条件培养基培养，比较两组细胞生长状况，2d或3d半量换液，6d时分别使用机械吹打、酶消化分离法和神经球裂解液分离法分离神经球，比较分离效果，倒置显微镜观察细胞形态，测定第3代细胞的生长曲线。

3. 神经干细胞鉴定

将第3代神经球经巢蛋白免疫组织化学染色鉴定；另一部分用神经球化学解离试剂分离成单个的细胞后，接种于预先经40g/L多聚赖氨酸包被的盖玻片并置于含血清撤去细胞因子的基础培养基中培养，倒置显微镜观察细胞形态及生物学特性，6d后检测神经元标志物神经元特异性烯醇化酶和星形胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白表达。将免疫组织化学染色阳性的细胞用图像分析软件分析。

4. 主要观察指标

悬浮培养的细胞形态、细胞表面标志免疫组织化学检测、第3代细胞的生长曲线^[1]。

神经干细胞神经元特异性染色图^[1]

神经干细胞的获得方式除组织直接分离外还有通过多能干细胞诱导分化形成，以iPSC诱导分化神经干细胞为例，具体操作方法如下：

1.iPS细胞传代培养

多能干细胞培养基培养iPS细胞系，待细胞密度达到70%~80%时，0.5mmol/L的EDTA消化4~5min，基础培养基清洗一次后，使用多能干细胞培养基将细胞吹起，1:3接种于基质胶预处理的6孔板上。

2.诱导iPSC向神经干细胞分化

1) 方法A: 6孔板中iPCS密度达到70%~80%，2:1接种至12孔板，24h后细胞融合密度几近100%，换诱导分化培养基( 神经培养添加剂含5mmol/L SB431542和5mmol/L drosomophorin)，记为第0天，隔天全换液。第8天，巴氏吸管将细胞刮下，1:2转入基质胶预处理的6孔板中，神经培养添加剂培养。第9天观察，细胞贴壁，换培养基，隔天全换液。第16天，dispase消化细胞，基础培养基清洗一次，神经干细胞维持培养基(神经培养添加剂含20μg/L EGF和20μg/L bFGF)，将细胞吹起，转入T25的培养瓶中。继续培养1周左右，传代。

2) 方法B: 6孔板中iPSC密度达到70%~80%，1:3接种至6孔板中，24h后细胞密度40%左右，换诱导分化培养基(神经那个培养添加剂含5mmol/L SB431542和1mmol/L drosomophorin)，记为第0天。此后操作同方法A。

3.神经干细胞传代

离心收集神经球，细胞解离试剂消化15min，待神经球变松散，F12洗1遍，收集细胞；将其吹成单细胞悬液。移至T25瓶，神经干细胞维持培养基(神经培养添加剂含20μg/L EGF和20μg/L bFGF)培养。1周左右，神经球较大，颜色变暗，不透明，即可传代^[2]。

两种方法分化神经干细胞不同天数图片^[2]

分化所得神经干细胞^[2]

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[1] 徐富翠,邹礼乐,梅欣明等.神经干细胞培养及其影响因素[J].中国组织工程研究,2013,17(10):1835-1840.

[2] 杨坦,刘华,汪运山.2种诱导iPSC向神经干细胞分化方法的比较[J].中国病理生理杂志,2015,31(01):188-192.